Клеточный конвейер при синтезе белка. Методы исследования в гистологии
C возникновением компартментов эукариотическая клетка получает не только очевидные преимущества, но и ряд проблем. Одной из них является сортировка и доставка нужных соединений в нужные органеллы. Прежде всего, это касается белков. Судьба синтезированных белков различна и зависит от мест их последующего функционирования. Существуют два магистральных пути транспорта белков, которые начинаются в разных местах цитоплазмы. Рис. 1.2.
Первая транспортная ветвь работает с белками, которые предназначены для пластид, митохондрий, ядра и пероксисом – то есть для всех компартментов клетки, кроме органелл эндомембранной системы. Синтез этих белков происходит на свободных рибосомах цитозоля. Белки, предназначенные для транспорта, содержат сигналы сортировки, направляющие их в соответствующие органеллы. Подобными сигналами обычно служат один или несколько участков белка, которые называют сигнальными, или лидерными пептидами. В мембране органеллы находится специальный белкок-транслокатор, который «узнает» сигнальный пептид. Молекула транспортируемого белка должна развернуться, чтобы подобно нитке развернувшегося клубка «продеться» через «игольное ушко» белка-транслокатора. В таблице 1.1. представлены некоторые характеристики различных сигналов сортироваки. Этот путь транспорта белков иогда называют цитозольным . Следует отметить, что большинство белков, ситезируемых на свободных рибосомах цитозоля не имеют сигналов сортировки и остаются в цитозоле в качестве постоянных компонентов.
Другая транспортная ветвь используется для секретируемых белков, а также для белков, предназначенных для органелл эндомембранной системы и плазматической мембраны. Синтез этих белков также начинается на рибосомах цитозоля, но после инициации трансляции рибосомы прикрепляются к мембране ЭР, при этом формируется шероховатый ЭР. Образующиеся белки переносятся в ЭР котрансляционно. Это означает, что сразу после синтеза очередного участка полипептидной цепи он пересекает мембрану ЭР. После синтеза некоторые из белков попадают в просвет ЭР, другие остаются закрепленными в мембране и становятся трансмембранными белками ЭР. Эту транспортную ветвь часто называют секреторным путем клетки.
Таблица 1.1. Сигнальные последовательности для транспорта белков в растительной клетке.
Целевая органелла | Сигнальная последовательность | Характеристика |
Хлоропласты: строма | N-концевой лидерный пептид («стромальный») | Последовательность из 40-50 аминокислот |
Хлоропласты: люмен и мембраны тилакоидов | Два последовательных N-концевых лидерных пептида | Первый пептид -«стромальный», второй – «люменальный» |
Митохондрии: матрикс | N-концевой пресиквенс | Формирует положительно заряженную амфипатическую α-петлю. |
Митохондрии: внутренняя мембрана, межмембранное пространство | Два последовательных N-концевых пресиквенса | Первый пресиквенс - как для белков матрикса, второй состоит из остатков гидрофобных аминокислот |
Пероксисомы | Сигналы пероксисомальной локализации PTS1 и PTS2 | PTS1 – С-концевой трипептид – Ser-Lys-Leu PTS2 локализован на N-конце. |
Ядро | Сигналы ядерной локализации NLS. Не отщепляются после переноса белка в ядро | NLS типа 1: Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys. NLS типа 2: две последовательности, разделенные спейсером NLS типа 3: Lys-Ile-Pro-Ile-Lys |
Сигнальный пептид секреторного пути | N-концевой лидерный пептид | 10-15 остатков гидрофобных аминокислот, формирующих α-спираль. |
Эндоплазматический ретикулум | Сигнал локализации в ЭР | С-концевой тетрапептид KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) |
Вакуоль. | Сигналы локализации в вакуолях NTPP, CTPP, внутрибелковый сигнал. | NTPP - N-концевой сигнал: Asn-Pro-lle-Arg CTPP – С-концевой сигнал. |
Две ветви транспорта различаются по схеме транспортировки. Пути цитозольного транспорта белков параллельны, то есть белки из цитозоля сразу направляется в нужную органеллу. Обычно проходит не больше одной - двух минут с момента высвобождения белка в цитозоль до поступления его в органеллу.
Транспорт белков по секреторному пути происходит последовательно – от органеллы к органелле. До достижения конечного пункта белок может побывать в нескольких органеллах (ЭР, разные отделы АГ). Путь от мембраны ЭР до места назначения может занять десятки, если не сотни минут. В процессе переноса белки могут претерпевать значительные модификации (прежде всего в АГ). На заключительных этапах транспорт может происходить параллельно - в вакуоль, периплазмитическое пространство или в плазмалемму.
И, наконец, два пути транспорта белков различаются по механизму переноса молекул. Для цитозольного пути возможен только мономолекулярный механизм транспорта белков, при котором каждая молекула белка индивидуально пересекает мембрану через соответствующий транслокатор. Для секреторного пути характерен везикулярный механизм транспорта белковых молекул, который опосредован транспортными пузырьками (везикулами). Везикулы отшнуровываются от одного компартмента, при этом происходит захват определенных молекул из его полости. Затем везикулы сливаются с другим компартментом, доставляя в него свое содержимое. При везикулярном транспорте белки не пересекают никаких мембран, транспорт может происходить только между топологически эквивалентными компартментами. Везикулярный механизм транспорта избирательно контролируется с помощью специальных белков, выполняющих функции сигналов сортировки. В транспортный пузырек белок попадает, если его сигнал сортировки связывается с рецептором на мембране везикулы. В настоящее время некоторые сигналы сортировки в составе белков известны, тогда как большинство комплементарных им мембранных рецепторов - нет.
1.2. Растительная клетка – результат двойного симбиоза.
Стратегия существования высших растений обусловлена прежде всего двумя их главными свойствами – фототрофным типом питания и отсутствием активной подвижности. Эти два свойства наложили отпечаток на все уровни организации растительного организма, вплоть до клеточного.
Помимо общих для всех эукариотических клеток признаков, клетки растений обладают рядом особенностей. Главные из них:
наличие пластид; наличие вакуолей; наличие жесткой клеточной стенки.
Схема строения типичной растительной клетки представлена на рис. 1.3.
Присутствие пластид связано, прежде всего, с фототрофным типом питания растений. Пластиды, как и митохондрии, имеют собственный геном. Таким образом, еще одной особенностью растительной клетки является то, что она совмещает в себе три относительно автономные генетические системы: ядерную (хромосомную), митохондриальную и пластидную. Наличие трех геномов является следствием симбиотического происхождения растительных клеток. При этом растительная клетка, в отличие от других эукариотических клеток, образовалась как минимум из трех исходно самостоятельных форм:
1) «хозяйского» организма, генетический аппарат которого переместился в ядро;
2) гетеротрофной бактерии (похожей на родоспириллу), послужившей предшественницей митохондрии;
3) древней бактерии с оксигенным фотосинтезом (похожей на цианобактерию синехоцистис), ставшей родоначальницей пластид.
Длительная коэволюция симбионтов привела к перераспределению функций между ними и их генетическими системами, при этом многие гены митохондриальной и пластидной ДНК были перемещены в ядро.
В обмене веществ организма ведущая роль принадлежит белкам и нуклеиновым кислотам. Белковые вещества составляют основу всех жизненно важных структур клетки, они входят в состав цитоплазмы. Белки обладают необычайно высокой реакционной способностью. Они наделены каталитическими функциями, т. е. являются ферментами, поэтому белки определяют направление, скорость и теснейшую согласованность, сопряженность всех реакций обмена веществ.
Рис. 13 А. Схема синтеза белка в эукариотной клетке.
Рис. 13 Б. Схема синтеза белка в прокариотной клетке.
Ведущая роль белков в явлениях жизни связана с богатством и разнообразием их химических функций, с исключительной способностью к различным превращениям и взаимодействиям с другими простыми и сложными веществами, входящими в состав цитоплазмы.
Нуклеиновые кислоты входят в состав важнейшего органа клетки - ядра, а также цитоплазмы, рибосом, митохондрий и т. д. Нуклеиновые кислоты играют важную, первостепенную роль в наследственности, изменчивости организма, в синтезе белка.
Процесс синтеза белка является очень сложным многоступенчатым процессом. Совершаем ся он в специальных органеллах - рибосомах. В клетке содержится большое количество рибосом. Например, у кишечной палочки их около 20000.
Каким образом происходит синтез белка в рибосомах?
Молекулы белков по существу представляют собой полипептидные цепочки, составленные из отдельных аминокислот. Но аминокислоты недостаточно активны, чтобы соединиться между собой самостоятельно. Поэтому, прежде чем соединиться друг с другом и образовать молекулу белка, аминокислоты должны активироваться. Эта активация происходит под действием особых ферментов. Причем каждая аминокислота имеет свой, специфически настроенный на нее фермент.
Источником энергии для этого (как и для многих процессов в клетке) служит аденозинтрифосфат (АТФ).
В результате активирования аминокислота становится более лабильной и под действием того же фермента связывается с т-РНК.
Важным является то, что каждой аминокислоте соответствует строго специфическая т-РНК. Она находит «свою» аминокислоту и переносит ее в рибосому. Поэтому такая РНК и получила название транспортной.
Следовательно, в рибосому поступают различные активированные аминокислоты, соединенные со своими т-РНК. Рибосома представляет собой как бы конвейер для сборки цепочки белка из поступающих в него различных аминокислот (рис. 13 Аи Б).
Возникает вопрос: от чего зависит порядок связывания между собой отдельных аминокислот? Ведь именно этот порядок и определяет, какой белок будет синтезирован в рибосоме, так как от порядка расположения аминокислот в белке зависит его специфика. В клетке содержится более 2000 различных по строению и свойствам специфических белков.
Оказывается, что одновременно с т-РНК, на которой «сидит» своя аминокислота, в рибосому поступает «сигнал» от ДНК, которая содержится в ядре. В соответствии с этим сигналом в рибосоме синтезируется тот или иной белок, тот или иной фермент (так как ферменты являются белками).
Направляющее влияние ДНК на синтез белка осуществляется не непосредственно, а с помощью особого посредника, той формы РНК, которая получила название матричной или информационной РНК (м-РНК или и-РНК).
Информационная РНК синтезируется в ядре под влиянием ДНК, поэтому ее состав отражает состав ДНК. Молекула РНК представляет собой как бы слепок с формы ДНК.
Синтезированная и-РНК поступает в рибосому и как бы передает этой структуре план - в каком порядке должны соединяться друг с другом поступившие в рибосому активированные аминокислоты, чтобы синтезировался определенный белок. Иначе, генетическая информация, закодированная в ДНК, передается на и-РНК и далее на белок.
Молекула информационной РНК поступает в рибосому и как бы прошивает ее. Тот ее отрезок, который находится в данный момент в рибосоме, определенный ко доном (триплет), взаимодействует совершенно специфично с подходящим к нему по строению триплетом (антикодоном) в транспортной РНК, которая принесла в рибосому аминокислоту. Транспортная РНК со своей аминокислотой подходит к определенному кодону и-РНК и соединяется с ним; к следующему, соседнему участку и-РНК присоединяется другая т-РНК с другой аминокислотой и так далее, до тех пор пока не будет считана вся цепочка и-РНК и пока не нанижутся все аминокислоты в соответствующем порядке, образуя молекулу белка. А т-РНК, которая доставила аминокислоту к определенному участку полипептидной цепи, освобождается от своей аминокислоты и выходит из рибосомы. Затем снова в цитоплазме к ней может присоединиться нужная аминокислота, и она снова перенесет ее в рибосому. В процессе синтеза белка участвует одновременно не одна, а несколько рибосом - полирибосомы.
Основные этапы передачи генетической информации: синтез на ДНК как на матрице и-РНК (транскрипция) и синтез в рибосомах полипептидной цепи по программе, содержащейся в и-РНК (трансляция), универсальны для всех живых существ. Однако временные и пространственные взаимоотношения этих процессов различаются у прои эукариотов.
У организмов, обладающих настоящим ядром (животные, растения), транскрипция и трансляция строго разделены в пространстве и времени: синтез различных РНК происходит в ядре, после чего молекулы РНК должны покинуть пределы ядра, пройдя через ядерную мембрану (рис. 13 А). Затем в цитоплазме РНК транспортируются к месту синтеза белка - рибосомам. Лишь после этого наступает следующий этап - трансляция.
У бактерий, ядерное вещество которых не отделено от цитоплазмы мембраной, транскрипция и трансляция идут одновременно (рис. 13 Б).
Современные схемы, иллюстрирующие работу генов, построены на основании логического анализа экспериментальных данных, полученных с помощью биохимических и генетических методов. Применение тонких электронно-микроскопических методов позволяет в буквальном смысле слова увидеть работу наследственного аппарата клетки. В последнее время получены электронно-микроскопические снимки, на которых видно, как на матрице бактериальной ДНК, в тех участках, где к ДНК прикреплены молекулы РНК-полимеразы (фермента, катализирующего транскрипцию ДНК в РНК), происходит синтез молекул и-РНК. Нити и-РНК, расположенные перпендикулярно к линейной молекуле ДНК, продвигаются вдоль матрицы и увеличиваются в длине. По мере удлинения нитей РНК к ним присоединяются рибосомы, которые, продвигаясь, в свою очередь, вдоль нити РНК по направлению к ДНК, ведут синтез белка.
Из всего сказанного следует, что местом синтеза белков и всех ферментов в клетке являются рибосомы. Образно выражаясь, это как бы «фабрики» белка, как бы сборочный цех, куда поступают все материалы, необходимые для сборки полипептидной цепочки белка из аминокислот. Природа же синтезируемого белка зависит от строения и-РНК, от порядка расположения в ней нуклеоидов, а строение и-РНК отражает строение ДНК, так что в конечном итоге специфическое строение белка, т. е. порядок расположения в нем различных аминокислот, зависит от порядка расположения нуклеоидов в ДНК, от строения ДНК.
Изложенная теория биосинтеза белка получила название матричной теории. Матричной эта теория называется потому, что нуклеиновые кислоты играют как бы роль матриц, в которых записана вся информация относительно последовательности аминокислотных остатков в молекуле белка.
Создание матричной теории биосинтеза белка и расшифровка аминокислотного кода является крупнейшим научным достижением XX века, важнейшим шагом на пути к выяснению молекулярного механизма наследственности.
Механизм синтеза небелковых веществ
Ядрышко
Это плотная гранула диаметром 1-3 мкм, интенсивно окрашивающаяся основными красителями. Главным компонентом ядрышка является специализированный участок хромосом (петли), или организатор ядрышка. Такие участки имеются в пяти хромосомах: 13-й, 14-й, 15-й, 21-й и 22-й; именно здесь располагаются многочисленные копии генов, кодирующих рибосомальные РНК.
При ЭМ в ядрышке описывают 3 компонента :
1. Фибриллярный компонент - множество тонких (5-8 нм) нитей, с преимущественной локализацией во внутренней части ядрышка. Это первичные транскрипты р-РНК.
2. Гранулярный компонент – это скопление плотных частиц диаметром 10-20 нм, они соответствуют наиболее зрелым предшественникам субьединиц рибосом.
3. Аморфный компонент – это зона расположения ядрышковых организаторов, очень бледно окрашенная зона. Здесь крупные петли ДНК, участвующие в транскрипции рибосомальной РНК, а так же белки, специфически связывающиеся с РНК. Гранулы и фибриллы формируют ядрышковую нить (нуклеолонему) , толщиной 60-80 нм. Поскольку ядрышко окружено хроматином, то он получает название перинуклеарный хроматин , а его часть, проникающая внутрь ядрышка – этоинтрануклеолярный хроматин.
Клеточный конвейер – это сборка секреторного продукта на живой конвейерной ленте при участии различных клеточных органелл. При этом процесс сборки слагается из ряда этапов, происходящих в определенной последовательности на участках клетки, достаточно далеко удаленных от места непосредственного действия нуклеиновых кислот, осуществляющих генетический контроль.
Клеточный конвейер при синтезе белка предусматривает обычную последовательность процессов, изложенную в разделе описания гранулярной эндоплазматической сети. Здесь уместно представить механизм синтеза небелковых веществ.
1. Транскрипция ДНК с образованием м-РНК
2. Образование в зоне ядрышка рибосомальной РНК
3. Сборка в зоне ядра предшественника рибосом
4. Поступление большой и малой субьединиц рибосом в цитоплазму
5. Синтез на свободных рибосомах ферментов для биосинтеза небелковых веществ (углеводов и липидов)
6. Поступление ферментов в гиалоплазму или гладкую ЭПС, где происходит синтез углеводов или липидов
7. Поступление этих веществ в комплекс Гольджи, формирование секреторной гранулы с выделением из клетки или сохранением веществ внутри клетки
Таким образом, липиды и углеводы синтезируются в цитоплазме и гладкой ЭПС, упаковываются в КГ с эффектом (“ минус- мембрана”).
Ферменты, принимающие участие в биосинтезе этих липидов – это интегральные мембранные белки, каталитические участки которых обращены в цитозоль. Синтез происходит с помощью нескольких ферментативных реакций. Новые липиды свободно диффундируют в плоскости бислоя и быстро смешиваются с липидами наружного слоя мембраны. Кроме того, фермент флиппаза может перемещать вновь синтезированные липиды во внутренний слой мембраны. Так происходит быстрое смешивание глицерофосфолипидов.
Контуры клетки, даже на светооптическом уровне, не представляются ровными и гладкими, а электронная микроскопия позволила обнаружить и описать в клетке различные структуры, которые отражают характер ее функциональной специализации. Различают следующие структуры:
1. Микроворсинки – выпячивание цитоплазмы, покрытые плазмолеммой. Цитоскелет микроворсинки сформирован пучком актиновых микрофиламент, которые вплетаются в терминальную сеть апикальной части клеток (рис. 5). Единичные микроворсинки на светооптическом уровне не видны. При наличии значительного их числа (до 2000-3000) в апикальной части клетки уже при световой микроскопии различают “ щеточную каемку”.
2. Реснички – располагаются в апикальной зоне клетки и имеют две части (рис. 6) : а) наружную - аксонему
б) внутреннюю – безальное тельце
Аксонема состоит из комплекса микротрубочек (9 + 1 пары) и связанных с ними белков. Микротрубочки образованы белком тубулином, а ручки – белком динеином – эти белки в совокупности формируют тубулин-динеиновый хемомеханический преобразователь.
Базальное тельце состоит из 9 триплетов микротрубочек, расположенных у основания реснички и служит матрицей при организации аксонемы.
3. Базальный лабиринт – это глубокие инвагинации базальной плазмолеммы с лежащими между ними митохондриями. Это механизм активного всасывания воды, а так же ионов против градиента концентрации.
1. Транспорт низкомолекулярных соединений осуществляется тремя способами:
1. Простая диффузия
2. Облегченная диффузия
Активный транспорт
Простая диффузия – низкомолекулярные гидрофобные органические соединения (жирные кислоты, мочевина) и нейтральные молекулы (Н О, СО, О). С увеличением разности концентраций между отсеками, разделенными мембраной, растет и скорость диффузии.
Облегченная диффузия – вещество идет через мембрану также по направлению градиента концентрации, но с помощью транспортного белка – транслоказы. Это интегральные белки, обладающие специфичностью в отношении переносимых веществ. Это, например, анионные каналы (эритроцит), К - каналы (плазмолемма возбужденных клеток) и Са - каналы (саркоплазматический ретикулум). Транслоказа для Н О – это аквапорин.
Механизм действия транслоказы:
1. Наличие открытого гидрофильного канала для веществ определенного размера и заряда.
2. Канал открывается только при связывании специфического лиганда.
3. Канала нет как такового, а сама молекула транслоказы, связав лиганд, поворачивается в плоскости мембраны на 180 .
Активный транспорт – это транспорт с помощью такого же транспортного белка (транслоказы), но против градиента концентрации. Это перемещение требует затрат энергии.
2. Транспорт через мембраны высокомолекулярных соединений
Переход частиц через плазмолемму происходит всегда в составе мембранного пузырька: 1. Эндоцитоз : а. пиноцитоз, б. фагоцитоз, в. эндоцитоз, опосредованный рецепторами.
Экзоцитоз: а. секреция, б. экскреция, в. рекреция – это перенос твердых веществ через клетку, здесь сочетается фагоцитоз и экскреция.
- 1. ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: изучить строение интерфазного ядра в фиксированных препаратах. Рассмотреть особенности строения ядер клеток с различной функ- циональной активностью. Основными компонентами ядра являются: ядерная оболочка (кариолемма),хроматин, ядрышко, ядерный сок. При световой микроскопии ядерная оболочка представляет четкую, очер- ченную со стороны ядра и цитоплазмы линию. При рассмотрении схемы ультрамикроскопического строения ядра следует обратить внимание на особенности строения кариолеммы, на связь ее мембран с эндоплазма- тической сетью цитоплазмы. Разобраться в морфологической харак- теристике хроматина и его химическом составе. Хроматин в ядре может находиться в виде глыбок –конденсированный хроматин или быть рас- пыленным – дисперсный хроматин. Разное состояние хроматина явля- ется показателем биосинтетической активности клетки. Клетки, активно синтезирующие белок имеют ядро с дисперсным хроматином и хорошо развитым ядрышком. В ядрах клеток, не синтезирующих белок, хроматин конденсированный, ядрышки плохо заметны.
- 2. Контрольные вопросы: 1. Ядро. Понятие об интерфазном ядре. Структурные компоненты ядра по данным световой и электронной микроскопии: ядерная оболочка, хроматин, ядрышко, ядерный сок. Значение и функции ядра в жизнедеятельности клетки. 2. Ядерно-цитоплазматические соотношения в клетках с различным уровнем метаболизма. 3. Структура ядерной оболочки при СМ и ЭМ. Молекулярная организация и функциональное значение ядерной ламины. 4. Ядерная пора и ядерный поровый комплекс. Участие в ядерном импорте и экспорте веществ. 5. Хроматин интерфазного ядра. Эухроматин и гетерохроматин. Хроматин, как показатель биосинтетической активности клетки. 6. Молекулярная организация ДНК в хромосомах. Уровни укладки хроматина. Роль гистоновых белков в обеспечении структуры хроматина и реализации генетической информации. 7. Ядрышко. Структура ядрышка при СМ и ЭМ. Основные компоненты ядрышка. Роль ядрышка в синтезе рРНК и образовании рибосом. 8. Синтез и транспорт биополимеров в клетке. Клеточный конвейер при синтезе белка. Морфологическая характеристика клетки, синтезирующей белки. 9. Клеточный конвейер при синтезе углеводов и липидов. Морфологическая характеристика клетки, синтезирующей углеводы и липиды.
- 3. Препарат 1 . Структуры ядра. Яичник. Окраска гематоксилин- эозином. Под малым увеличением сделать общий обзор микропрепарата,найти рас- тущий фолликул с яйцеклеткой. Под большим увеличением найти крупную округлую клетку – яйцеклетку и рассмотреть структуру ядра. Обратить вни- мание на ядерную оболочку, ядрышко, состояние хроматина. Нарисовать яйцеклетку и обозначить структуры интерфазного ядра. Изучить электрон- нограмму ядра. Зарисовать строение кариолеммы и ядерного порового комплекса.
- 4. Препарат 1 . Структуры ядра. Яичник. Яйцеклетка. Окраска гематоксилин-эозином
- 5. Препарат 2. Поджелудочная железа. Окраска гематоксилин- эозином. Клетка, синтезирующая белок. Под малым увеличением сделать общий обзор микропрепарата и найти экзокринную часть поджелудочной железы. Под большим увеличением рассмотреть одну клетку, обратив внимание на наличие в ядре ядрышка и эухроматина, отметить базофилию цитоплазмы в базальной части клетки и оксифилию в апикальной.
- 6. Препарат 2. Поджелудочная железа. Окраска гематоксилин-эозином. Клетки, синтезирующие белки
- 7. Препарат 3. Печень. Гликоген в клетках печени. ШИК-реакция. Клетка, синтезирующая углеводы. Под малым увеличением сделать общий обзор микропрепарата и найти группу гепатоцитов. Под большим увеличением рассмотреть в цитоплазме гепатоцита глыбки гликогена красно-фиолетового цвета.
- 8. Препарат 3. Печень. Гликоген в клетках печени. ШИК-реакция. Клетка, синтезирующая углеводы.
- 9. Препарат 4. Липидные включения в клетках печени. Окраска осмиевой кислотой. Клетка, синтезирующая липиды. Под малым увеличением сделать общий обзор микропрепарата и найти группу гепатоцитов. Под большим увеличением рассмотреть цитоплазму гепатоцита, обратив внимание на капли липидов,окрашенные в черный цвет.
- 10. Препарат 4. Липидные включения в клетках печени. Окраска осмиевой кислотой. Клетки, синтезирующие липиды.