Сложные методы окрашивания микроорганизмов позволяют определить. Окрашивание микропрепаратов
Бактериоскопический метод исследования предусматривает изучение микроорганизмов в живом или фиксированном и окрашенном состоянии. Для изучения микроорганизмов в живом состоянии используют метод раздавленной капли и метод висячей капли. Наиболее часто применяют микроскопию бактерий в фиксированном и окрашенном состоянии.
Для приготовления фиксированного и окрашенного препарата на обезжиренное предметное стекло наносят каплю воды или изотонического раствора хлорида натрия, в которую петлей вносят исследуемый материал и распределяют его таким образом, чтобы получить тонкий и равномерный мазок диаметром около 1-1,5 см. Если исследуют жидкий материал, то его непосредственно петлей наносят на предметное стекло и готовят мазок. Мазки высушивают на воздухе.
Для фиксации используют физические и химические методы. Для фиксации мазка физическим методом предметное стекло медленно проводят 3 раза через пламя горелки. Мазки крови, мазки-отпечатки органов и тканей фиксируют химическим методом путем погружения их на 5-20 минут в метиловый или этиловый спирт, смесь Никифорова и другие фиксирующие жидкости.
Для окрашивания микробов используют простые и сложные методы. При простом методе фиксированный мазок окрашивают каким-либо одним красителем, например, водным раствором фуксина (1-2 минуты) или метиленовым синим (3-5 минут), промывают водой, высушивают и микроскопируют. Сложные методы окрашивания включают использование нескольких красителей. Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других.
Окраска по Граму:
1. На фиксированный мазок наносят карболово-спиртовый раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 2-3 минуты ее снимают, а краситель сливают.
2. Наносят раствор Люголя на 1-2 минуты.
3. Обесцвечивают препарат этиловым спиртом в течение 30-60 секунд до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.
4. Промывают препарат водой.
5. Докрашивают мазок водным раствором фуксина в течение 1-2 минут, промывают водой, высушивают и микроскопируют.
Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные – в красный цвет.
При окраске по методу Грама в модификации Синева на первом этапе используют фильтровальные бумажки, пропитанные генциановым или кристаллическим фиолетовым. Для этого полоски бумаги пропитывают 1% раствором красителя и высушивают. На фиксированный мазок помещают пропитанную красителем бумажку, заливают небольшим количеством воды и выдерживают в течение 2 минут. После этого бумажку удаляют пинцетом, сливают краску и, не промывая препарат водой, наносят раствор Люголя. Последующее окрашивание проводят общепринятым методом.
Распределение микроорганизмов в зависимости от окраски по Граму:
1. Грамположительные бактерии:
Кокки (за исключением гонококков и менингококков);
Бациллы и клостридии (спорообразующие палочки);
Микобактерии, коринебактерии и листерии.
2. Грамотрицательные бактерии:
Некоторые кокки (гонококки и менингококки);
Все остальные палочковидные бактерии;
Все извитые формы (вибрионы, спириллы, спирохеты).
Структура бактериальной клетки
Структурные компоненты бактериальной клетки делят на 2 вида:
- основные структуры (клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана с ее производными, цитоплазма с рибосомами и различными включениями, нуклеоид);
- временные структуры (капсула, слизистый чехол, жгутики, ворсинки, эндоспоры, образующиеся лишь на определенных этапах жизненного цикла бактерий).
Основные структуры.
Клеточная стенка находится с внешней стороны от цитоплазматической мембраны. Цитоплазматическая мембрана не входит в состав клеточной оболочки. Функции клеточной стенки:
Защита бактерий от осмотического шока и других повреждающих факторов;
Определение формы бактерий;
Участие в метаболизме бактерий;
Токсичность за счет наличия поверхностных антигенов (у некоторых патогенных бактерий);
Наличие рецепторов для бактериофагов (у части бактерий).
В 1884 году датский микробиолог Ганс Христиан Грам предложил метод окраски бактерий с использованием генцианвиолета, йода, этилового спирта и фуксина. Все бактерии в зависимости от окраски по Грамму подразделяют на 2 группы: грамположительные и грамотрицательные бактерии.
Клеточная стенка грамположительных бактерий состоит из одного толстого слоя пептидогликана и тейхоевых кислот. Пептидогликан (муреин) – это многослойный линейный полимер, в котором чередуются остатки N-ацетилмурамовой кислоты и N-ацетилглюкозамина. У грамположительных бактерий содержание пептидогликана составляет от 50 до 90%. Слои пептидогликана связаны (прошиты) между собой тейхоевой и липотейхоевой кислотами. Тейхоевые кислоты выступают на поверхности клеточной стенки и являются главными антигенами грамположительных бактерий. Клеточная стенка грамположительных бактерий плотно прилегает к цитоплазматической мембране, ее толщина составляет 20-100 нм.
Грамположительные бактерии прочно фиксируют комплекс генцианвиолета и йода, не обесцвечиваются этанолом и поэтому не воспринимают дополнительный краситель фуксин, в результате чего клетка остается окрашенной в фиолетовый цвет.
Клеточная стенка грамотрицательных бактерий состоит из 2-х тонких слоев. Внутренний слой (периплазма ) представлен пептидогликаном в виде тонкой непрерывной сетки. У грамотрицательных бактерий содержание пептидогликана составляет 1-10%. Наружный слой (внешняя мембрана ) состоит из липополисахарида , белков и фосфолипидов. Толщина клеточной стенки грамотрицательных бактерий составляет 14-17 нм. Липополисахариды всех грамотрицательных бактерий обладают токсическими и пирогенными свойствами и называются эндотоксинами . У грамотрицательных бактерий комплекс генцианвиолета с йодом легко вымывается из клетки этанолом, и после дополнительного нанесения фуксина клетка окрашивается в красный цвет.
В некоторых условиях бактерии лишаются способности полностью или частично синтезировать компоненты клеточной стенки, в результате чего образуются протопласты, сферопласты и L-формы бактерий. Сферопласты – это бактерии с частично разрушенной клеточной стенкой с сохранением элементов наружной мембраны. Они наблюдаются у грамотрицательных бактерий. Протопласты - это формы, полностью лишенные клеточной стенки. Они образуются грамположительными бактериями. L-формы бактерий - это мутанты бактерий, частично или полностью утратившие способность синтезировать пептидогликан клеточной стенки (бактерии с дефектной клеточной стенкой). Свое название они получили от названия института Листера в Англии, где были открыты в 1935 году.
Цитоплазматическая мембрана (ЦПМ) и ее производные. Цитоплазматическая мембрана (плазмолемма) - это полупроницаемая липопротеидная структура бактериальной клетки, отделяющая цитоплазму от клеточной стенки. Она составляет 8-15% сухой массы клетки. Ее разрушение приводит к гибели клетки. При электронной микроскопии выявлено ее трехслойное строение. Цитоплазматическая мембрана представляет собой комплекс белков (50-75%) и липидов (15-20%). Основная масса липидов представлена фосфолипидами. Кроме того, в составе мембраны обнаружено небольшое количество углеводов.
ЦПМ бактерий выполняет следующие функции:
Барьерная функция (молекулярное “сито”);
Избирательный перенос различных органических и неорганических молекул и ионов с помощью специальных переносчиков – транслоказ или пермеаз;
Превращение клеточной энергии;
Репликация и последующее разделение хромосомы.
В процессе роста клетки цитоплазматическая мембрана образует многочисленные впячивания (инвагинаты), получившие название мезосом . По морфологическим особенностям различают ламеллярные (пластинчатые), везикулярные (имеющие форму пузырьков), тубулярные (трубчатые) мезосомы.
Цитоплазма - это содержимое бактериальной клетки, ограниченное цитоплазматической мембраной. Она состоит из цитозоля и структурных элементов.
Цитозоль - гомогенная фракция, включающая растворимые компоненты РНК, ферменты, продукты метаболизма.
Структурные элементы - это рибосомы, внутрицитоплазматические мембраны, включения и нуклеоид.
Рибосомы - органоиды, осуществляющие биосинтез белка. Они состоят из белка и РНК. Представляют собой гранулы диаметром 15-20 нм. Одна бактериальная клетка содержит от 5000 до 50000 рибосом. Рибосомы являются местом синтеза белка.
В цитоплазме прокариот обнаруживаются различные включения, представляющие запасные вещества клетки. Из полисахаридов в клетках откладываются гликоген, крахмал и крахмалоподобное вещество - гранулеза. Полифосфаты содержатся в гранулах, называемых волютиновыми , или метахроматиновыми , зернами.
Нуклеоид является аналогом ядра у прокариот. Он состоит из одной замкнутой в кольцо двуспиральной нити ДНК, которую рассматривают как бактериальную хромосому. У нуклеоида отсутствует ядерная оболочка.
Кроме нуклеоида в бактериальной клетке обнаружены внехромосомные генетические элементы – плазмиды , которые представляют собой небольшие кольцевые молекулы ДНК, способные к автономной репликации. Роль плазмид состоит в том, что они кодируют дополнительные признаки, дающие клетке преимущества в определенных условиях существования. Наиболее распространены плазмиды, детерминирующие признаки антибиотикорезистентности бактерий (R-плазмиды), синтез энтеротоксинов (Ent-плазмиды) или гемолизинов (Hly-плазмиды).
К временным структурам относятся капсула, жгутики, пили, эндоспоры бактерий.
Капсула - это слизистый слой на поверхности клеточной стенки бактерий. Капсула синтезируется на наружной поверхности цитоплазматической мембраны и выделяется на поверхность клеточной стенки в специфических участках.
Функции капсулы:
Место локализации капсульных антигенов, определяющих вирулентность, антигенную специфичность и иммуногенность бактерий;
Защита клеток от механических повреждений, высыхания, токсических веществ, заражения фагами, действия защитных факторов макроорганизма;
Способность прикрепления клеток к субстрату.
Жгутики – это органы движения бактерий. Жгутики не являются жизненно важными структурами, поэтому могут присутствовать у бактерий или отсутствовать в зависимости от условий выращивания. Количество жгутиков и места их расположения у разных бактерий неодинаково. В зависимости от этого выделяют следующие группы жгутиковых бактерий:
- монотрихи – бактерии с одним полярно расположенным жгутиком;
- амфитрихи – бактерии с двумя полярно расположенными жгутиками или имеющие по пучку жгутиков на обоих концах;
- лофотрихи – бактерии, имеющие пучок жгутиков на одном конце клетки;
- перитрихи – бактерии с множеством жгутиков, расположенных по бокам клетки или на всей ее поверхности.
Химический состав жгутиков представлен белком флагеллином .
К поверхностным структурам бактериальной клетки относятся также ворсинки и пили . Эти структуры участвуют в адсорбции клеток на субстрате (ворсинки, пили общего типа) и в процессах переноса генетического материала (половые пили). Они образованы специфическим гидрофобным белком пилином.
У некоторых бактерий в определенных условиях образуются покоящиеся формы, которые обеспечивают переживание клеток в течение длительного времени в неблагоприятных условиях - эндоспоры . Они устойчивы к неблагоприятным факторам внешней среды.
Расположение спор в клетке:
Центральное (возбудитель сибирской язвы);
Субтерминальное - ближе к концу (возбудитель ботулизма);
Терминальное – на конце палочки (возбудитель столбняка).
Простой метод окраски. Является одноэтапным и заключается в окраске микропрепарата одним красителем. Используют основные анилиновые красители, такие как, фуксин, генцианвиолет, метиленовый синий в виде водных растворов или пропитанных красителем фильтровальных бумажек, которые помещают на мазок и смачивают водой. Продолжительность окраски составляет 3-5 минут, после чего микропрепарат промывают водой, высушивают и микроскопируют. В препаратах, окрашенных простым методом, можно получить представление о форме, расположении и размерах микробных клеток.
Сложные методы окраски. Сложные (дифференцирующие) методы окраски (по Граму, Цилю-Нильсену и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и дополнительных способов обработки препаратов. Эти методы позволяют дифференцировать бактерии в зависимости от строения их структур, чаще всего поверхностных. Например, метод окраски по Граму позволяет дифференцировать бактерии по строению их клеточной стенки: грамположительные (фиолетовые) с толстой и грамотрицательные (красные) бактерии с тонкой клеточной стенкой.
Существуют специальные сложные методы окраски, которые используют для выявления структурных компонентов бактериальной клетки: капсул, цитоплазматических включений, спор, жгутиков.
Механизмы окрасок по Граму и Цилю-Нильсену
Метод Грама. Относится к сложным методам окраски и позволяет дифференцировать грамположительные и грамотрицательные бактерии, что является важным таксономическим признаком. Результат окраски определяется особенностями строения клеточной стенки бактерий. При окраске генцианвиолетом и последующем воздействии раствора Люголя образуется комплексное соединение генцианвиолета и йода с пептидогликаном, которое при дифференциации спиртом удерживается в клетках грамположительных бактерий, имеющий многослойный пептидогликан и вымывается из грамотрицательных бактерий, имеющих тонкий слой пептидогликана. При дополнительной окраске водным раствором фуксина грамотрицательные бактерии приобретают красный цвет.
Таблица 4. Метод Грама
Этапы окраски | Цвет бактерий |
1. На фиксированный мазок поместить фильтровальную бумажку, пропитанную генцианвиолетом, смочить водой, 2-3 минуты | Все бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет |
2. Снять бумажку, слить с препарата оставшуюся краску и налить раствор Люголя на 1 минуту | Все бактерии остаются фиолетовыми |
3. Для дифференцирования нанести на мазок этиловый спирт и обесцветить в течение 30-60 с, промыть водой | Грамположительные бактерии остаются фиолетовыми, грамотрицательные обесцвечиваются |
4. Нанести фуксин Пффейфера (водный раствор фуксина) и докрасить 1-2 мин, промыть водой, высушить | Грамположительные остаются фиолетовыми, грамотрицательные окрашиваются в красный цвет |
Метод Циля-Нильсена. Относится к сложным методам окраски и позволяет дифференцировать кислотоустойчивые и некислотоустойчивые бактерии.
Таблица 5. Метод Циля-Нильсена
Кислотоустойчивые бактерии имеют особое строение клеточной стенки, содержащей большое количество сложных липидов (миколовых кислот, восков, глико- и фосфолипидов), что делает эти бактерии кислото-, щелоче- и спиртоустойчивыми. Клеточная стенка этих бактерий плохо воспринимает анилиновые красители и обычные способы окраски. Высокая температура в процессе окраски методом Циля-Нильсена расплавляет липиды, фенол разрыхляет клеточную стенку и краситель проникает внутрь клетки. После остывания препарата липиды вновь затвердевают, прочно удерживая краситель, поэтому кислотоустойчивые бактерии не обесцвечиваются серной кислотой и остаются красными. Некислотоустойчивые бактерии обесцвечиваются и их докрашивают контрастным красителем – метиленовым синим. В основном, метод используется для окраски бактерий, относящихся к роду Mycobacterium (M.leprae, M.tuberculosis, M,bovis и др.)
III. План практической работы
1. Изучить механизм и этапы окраски по Граму, приготовить мазок из смеси бактерий и окрасить по Граму, заполнить таблицу в рабочей тетради.
2. Изучить механизм и этапы окраски по Цилю-Нильсену, приготовить мазок из сапрофитных микобактерий, окрасить по Цилю-Нильсену, заполнить таблицу в рабочей тетради.
3. Сравнить строение прокариотической и эукариотической клетки по ряду признаков, заполнить таблицу в рабочей тетради.
4. Изучить и перечислить в таблице основные таксономические категории на примере C.tetani и T.pallidum или других бактерий.
Окраска мазков по методу Грамма Наиболее распространенный метод окраски бактерий, позволяющий отнести клетки по типу окраски стенки к грациликутам (грамотрицательным) или фирмикутам (грамположительным).
На фиксированный мазок накладывают кусочек фильтровальной бумаги, на него наливают карболовый раствор генцианвиолета на 30-50 секунд. Сливают краситель, удаляют бумажку, наносят раствор Люголя на 60 секунд. Сливают раствор Люголя. Споласкивают препарат в 95° этаноле 30-50 секунд, пока не перестанет отходить краситель, что зависит от толщины мазка. Промывают препарат водой, докрашивают 30-60 секунд фуксином Пфейффера, промывают водой, подсушивают и микроскопируют. Микроскопическая картина: грамположительные бактерии - фиолетового, грамотрицательные - красного цвета.
Практика показывает, что более чистые препараты без ущерба для дифференциации получаются, если после окраски генцианвиолетом мазок слегка споласкивают водой, остатки которой стряхивают и только потом наносят раствор Люголя.
Модификация по А.П. Синеву. На фиксированный мазок кладут полоску бумаги с красителем, наливают 2-3 капли воды и окрашивают 2 минуты. Далее поступают как описано выше.
Модификация по Керри. Мазок окрашивают 1-2 минуты спиртовым раствором генцианвиолета, обрабатывают 1-2 минуты раствором йода, затем 30-40 секунд этанолом. Промывают. Повторно обрабатывают 1 минуту раствором йода, промывают, докрашивают 1-2 минуты фуксином или смесью сафранина с бриллиантовой зеленью.
Модификация Берка. Раствор А: 1%-ный раствор кристаллвиолета в дистиллированной воде.
Протрава: йод кристаллический – 1 г, йодистый калий - 2 г, дистиллированная вода – 100 мл.
Растворитель для обесцвечивания: этиловый эфир – 1 объем, ацетон – 3 объема.
Дополнительный краситель: 2%-ный раствор сафранина в дистиллированной воде.
Методика. Фиксированный нагреванием мазок погружают в раствор А, Мазок ополаскивают в йодной протраве и покрывают его свежей протравой на 2 мин. Промывают водой, а затем растворителем для обесцвечивания до тех пор, пока стекающий растворитель не будет содержать краски. После подсушивания окрашивают дополнительными красителем 5-10 сек, промывают водой, микроскопируют.
Модификация Хукера
Раствор А: кристаллвиолет – 2 г, 95%-ный этанол - 20 мл.
Раствор Б: щавелевокислый аммоний – 0,8 г, дистиллированная вода - 80 мл.
Раствор А и Б в приготовленных объемах смешивают в темном флаконе и оставляют при комнатной температуре на 24 ч.
Раствор В: 2,5%-ный раствор сафранина (в 96%-ном этаноле) – 10 мл, дистиллированная вода - 100 мл.
Методика. Фиксированный нагреванием мазок погружают в смесь растворов А и Б на 1 мин, после чего препарат промывают водой и обрабатывают раствором Люголя 1 мин, затем вновь промывают водой и подсушивают; наносят 96%-ный этанол на 30 с, препарат тщательно промывают водой, подсушивают, помещают в раствор В на 10 секунд, слегка промывают водой, подсушивают, микроскопируют.
Тест с гидроксидом калия для контроля результатов окраски бактерий по Граму. Если окраска по Граму нечеткая, этот метод позволяет уточнить полученный результат.
Постановка теста. На предметное стекло наносят 1-2 капли 3%-ного раствора КОН. Агаровую культуру бактериологической петлей вносят в КОН, перемешивают и затем поднимают петлю вверх. Если культура в виде «нити» тянется за петлей - грамотрицательная, при отсутствии этого феномена - грамположительная бактерия.
Методы окраски кислотоустойчивых бактерий
Окраска по Циль-Нильсену. Готовят карболфуксиновый краситель: основной фуксин – 0,3 г, 95%-ный этанол - 10 мл, фенол (кристаллы, расплавленные при нагревании) - 5 мл, дистиллированная вода – 95 мл.
Основной фуксин растворяют в этаноле, добавляют растворенный в воде фенол, перемешивают, выдерживают 5-7 дней при комнатной температуре; перед использованием фильтруют через фильтровальную бумагу.
Растворитель для обесцвечивания (солянокислый спирт): этанол 95%-ный - 97 мл, соляная кислота концентрированная - 3 мл. Дополнительный краситель: метиленовый синий - 0,3 г, дистиллированная вода -100 мл.
Методика. На фиксированный нагреванием мазок наливают карбол-фуксиновый краситель, подогревают до отхождения паров (но не кипятить!). Через 5 минут промывают водой. Затем мазок обрабатывают 30-50 сек растворителем для обесцвечивания, промывают водой, после чего пленка бактерий на мазке становится бледно-розовой.
Мазок докрашивают 3-5 минут дополнительным красителем (метиленовый синий и т.д.), промывают водой, высушивают.
Кислотоустойчивые микроорганизмы в мазке красного цвета, другие - синего.
Окраска аурамином. Раствор А: аурамин - 1,5 г, родамин В - 0,75 г, глицерин - 75 мл, фенол расплавленный - 10 мл, вода дистиллированная - 50 мл.
Красители: фенол и глицерин растворяют в 25-30 мл воды, добавляют оставшийся объем воды и фильтруют через стекловату.
Раствор Б: 70%-ный этанол - 99,5 мл, кислота соляная концентрированная - 0,5 мл.
Раствор В: калий марганцевокислый - 0,5 г, вода дистиллированная - 99,5 мл.
Методика. Фиксированный над пламенем горелки мазок 15 мин окрашивают раствором А при комнатной температуре или при 37-38° С. Промывают под струей воды до обесцвечивания. Наливают на мазок на 3-5 мин раствор Б, промывают и докрашивают еще 2-4 мин раствором В. Промывают, высушивают, микроскопируют в люминесцентном микроскопе под иммерсией (возбуждающий светофильтр ВG-12, запирающий ОG-1).
Кислотоустойчивые бактерии желто-оранжевого цвета на темном фоне.
Окраска по Муху. Препарат выдерживает 24 часа в растворе метилвиолета (10 мл насыщенного спиртового раствора метилвиолета, 100 мл 2%-ного водного раствора карболовой кислоты). На 1-2 минуты наносят раствор Люголя, далее на 1 мин 5%-ный раствор азотной кислоты и 10 секунд 3%-ный раствор соляной кислоты. Затем на препарат до прекращения отхождения краски наносят смесь этанола и ацетона (1:1), промывают водой, высушивают и микроскопируют.
Методы окраски спор
Метод Ауески. Высушенный на воздухе мазок без фиксации обрабатывают 2-3 мин (при подогревании) 0,5%-ной серной кислотой, промывают и фиксируют над пламенем. Окрашивают в течение 7-8 мин карболовым фуксином Циля при подогревании, краску сливают. Мазок обрабатывают 5-7 секунд 5%-ным раствором серной кислоты, промывают и докрашивают 4-5 мин метиленовой синью. При микроскопии вегетативная часть клетки синего, спора - красного цвета.
Метод Меллера. Фиксированный над пламенем мазок протравливают 2-3 мин 5%-ной хромовой кислотой, промывают, окрашивают карболовым фуксином Циля. Обесцвечивают и окрашивают также, как и по методу Ауески.
Метод Пешкова. Фиксированный мазок окрашивают метиленовой синью с подогревом до закипания. Краску смывают и докрашивают 1%-ным водным раствором нейтральрота в течение 10 секунд. Промывают, высушивают. Споры синие, вегетативные клетки - красные.
Метод Шеффера-Фултона. На фиксированный нагреванием мазок, покрытый фильтровальной бумагой, наливают 0,5%-ный водный раствор малахитовой зелени. Мазок помещают на 5 мин над кипящей водой. Промывают и докрашивают 30 сек 2%-ным водным раствором сафранина. Промывают, высушивают. Споры ярко-зеленого цвета, вегетативные клетки - красно-коричневого.
Метод Трухильо. Мазок фиксируют над пламенем горелки, покрывают насыщенным водным раствором малахитовой зелени, подогревают до появления пара и окрашивают 3 минуты. Краску смывают водой и докрашивают мазок 0,25%-ным водным раствором основного фуксина в течение 1 мин. Промывают, высушивают. Споры зеленого цвета, вегетативные клетки - красного.
Метод Дорнера. Фиксированный на пламени горелки мазок окрашивают в течение 5-10 мин карболовым фуксином при подогревании, 1 мин обесцвечивают солянокислым спиртом (3 мл концентрированной соляной кислоты и 97 мл 96%-ного этанола). Препарат промывают, высушивают фильтровальной бумагой и наливают на мазок тонким слоем 10%-ный раствор нигрозина в 0,5%-ном растворе формалина. Не промывая, мазок высушивают на воздухе и микроскопируют. Споры - красные, вегетативные клетки - бесцветные на черном фоне.
Метод Валъдмана. На фиксированный препарат наносят синьку Леф-лера (щелочную) и нагревают до кипения, затем охлаждают и промывают водой. Докрашивают 1%-ным раствором нейтральрот в течение 30 секунд. Микроскопическая картина: споры - синие, вегетативные клетки - красные.
Метод Ожешки. На нефиксированный мазок наливают 0,5%-ный раствор НС1 и подогревают 1-2 минуты. Сливают кислоту, промывают препарат водой, подсушивают, фиксируют на пламени и окрашивают по методу Циль-Нильсена. Микроскопическая картина: споры – красного, вегитативные клетки – синего цвета.
Методы окраски капсул
Способ Романовского-Гимза. Фиксированный в этаноле или жидкости Никифорова мазок помещают в краску Романовского-Гимза (15-20 капель краски на 10 мл дистиллированной воды) на 15-20 мин. Промывают, высушивают. Тело бактерий окрашивается в темно-синий цвет, капсулы - в розовый.
Способ Ольта. Фиксированные мазки над пламенем горелки окрашивают 1-3 мин 2%-ным водным раствором сафранина (сафранин растворяют в горячей воде, фильтруют, применяют свежеприготовленный раствор). Тело бактерий окрашивается в коричневый цвет, капсула - в бледно-желтый.
Способ Ребигера. Нефиксированный мазок окрашивают в течение 15-20 сек раствором генцианвиолета в формалине (15-20 г генцианвиолета растворяют в 100 мл 40%-ного формалина, отстаивают, фильтруют), промывают водой. Тело бактерий - темно-фиолетового цвета, капсула - красновато-фиолетового.
Способ Антоны. Мазок окрашивают 2 мин 1%-ным водным раствором кристаллвиолета. Краску смывают 20%-ным водным раствором сульфата меди (СuSO 4 ·5Н 2 О), избыток раствора стряхивают и мазок, не промывая водой, высушивают фильтровальной бумагой. Микробы - темно-фиолетовые, капсула - светло-голубая.
Способ Гинса. На предметное стекло наносят каплю черной туши, раз-веденной 1:3 дистиллированной водой и центрифугируют при 3000 об/мин 15 мин. В капле туши суспензируют петлей культуру и делают мазок (подобно мазку крови). Высушивают, фиксируют над пламенем горелки, окрашивают карболфуксином Циля, разведенным 1:3. Тела бактерий - красные. Капсула на темном фоне видна в виде светлого ореола вокруг бактерий.
Способ Михина. Мазок окрашивают в течение 3-5 мин синькой Леф-флера (пригодна только краска, хранившаяся не менее 20-30 дней, т.к. при хранении в ней образуется азур, придающий метахроматичность). Тела бактерий - синие, капсула - розовая.
Способ Гисса. На предметное стекло наносят каплю нормальной сыворотки крови крупного рогатого скота или лошади (или каплю обезжиренного молока), петлей вносят в нее культуру, суспензируют и готовят мазок. Высушивают пленку бактериальной суспензии на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и окрашивают при подогревании в течение 1 мин 0,1%-ным водным кристаллвиолета. Мазок промывают 20%-ным водным раствором сульфата меди, высушивают фильтровальной бумагой. Капсулы в мазке - бледно-голубого, тела бактерий - темно-фиолетового цвета.
Способ Дюгида. На предметное стекло помещают каплю черной туши, суспензируют в ней культуру. Каплю покрывают покровным стеклом, фильтровальной бумагой удаляют излишки туши. На коричнево-черном фоне видны преломляющие свет бактерии, окруженные капсулой в виде прозрачной зоны.
Способ Ионе. На один конец поверхности предметного стекла наносят каплю туши, разведенной 1:2-1:4 дистиллированной водой. В капле суспензируют бактерии и готовят мазок (как мазок из крови). Препарат высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и окрашивают 2 мин 2%-ным водным раствором генцианвиолета или 1%-ным раствором фуксина. Промывают водой, обрабатывают 8-10 секунд 2%-ным раствором уксусной кислоты и вновь промывают. В мазке вокруг интенсивно окрашенных бактерий видна неокрашенная капсула.
Метод окраски жгутиков
О наличии жгутиков у бактерий судят по косвенным признакам, например по подвижности клеток в препаратах «раздавленная капля», «висячая капля», а также по характеру роста испытуемой культуры в полужидком агаре (0,15-0,3%). В последнем случае испытуемую культуру засевают уколом в ПЖА и инкубируют в течение 18-24 часов. В процессе роста подвижные бактерии мигрируют от линии укола, вызывая помутнение среды, неподвижные растут только по уколу.
В отдельных случаях применят методы окраски, позволяющие наблюдать непосредственно жгутикию
При всех методах окраски следует готовить препараты из молодых агаровых культур (14-20-часового роста). В пробирки с культурой на скошенном агаре на 30-40 мин добавляют 0,5%-ный водный раствор пептона. Жидкость отстаивают, для осаждения перешедших в нее микробов, центрифугируют. Осадок заливают физиологическим раствором и центрифугируют повторно. С целью предотвращения потери жгутиков отмытый осадок ресуспензируют в 10%-ном растворе формалина для получения слегка мутной суспензии.
Окраска жгутиков осмиевой кислотой. На чистом обезжиренном предметном или часовом стекле смешивают каплю суспензии бактерий с каплей 2%-ного раствора осмиевой кислоты. Полученную каплю смеси тонким капилляром пастеровской пипетки наносят на чистое обезжиренное предметное стекло. Высушивают на воздухе и фиксируют на пламени (избегать перегревания!).
На фиксированный препарат наливают протраву, приготовленную за несколько суток (1 мл насыщенного спиртового раствора фуксина, 10 мл 20%-ного водного раствора танина и 5,5 мл насыщенного водного раствора сернокислого аммиака железа). Через 15 мин протраву смывают водой, докрашивают 4 мин фуксином, промывают и микроскопируют.
Окраска жгутиков серебрением. Из суспензии готовят тонкий мазок, высушивают и фиксируют в течение 2-3 минут 2%-ным раствором осмиевой кислоты. Промывают препарат, погружением на 2-3 с в 0,5%-ный водный раствор азотнокислого серебра и, не промывая, опускают на 2-3 с в протраву (пирогаллол или галловая кислота - 2,0 г, танин – 1,2 г, натрий уксуснокислый – 4,0 г, вода дистиллированная - 150 мл). Вынимают из протравы и снова погружают в раствор азотнокислого серебра, выдерживая до тех пор, пока препарат не почернеет. После промывки проводят микроскопию.
Окраска жгутиков по Плиммеру. Готовят краску: танин - 5,0 г, цинк хлористый - 5,0 г, алюминий хлористый - 10,0 г, фуксин в порошке – 0,75 г навески перечисленных компонентов растирают в ступке, постепенно порциями добавляя 40 мл 60%-ного этанола до их полного растворения. Перед употреблением краску разводят водой (1:5).
На высушенный тонкий мазок кладут полоску фильтровальной бумаги и заливают приготовленной краской. Через 2 мин краску смывают водой и дополнительно окрашивают карболовым фуксином Циля. Бактерии и жгутики - красного цвета.
Окраска жгутиков по Беничетти. Заранее готовят 3 раствора. Раствор 1: цинк сернокислый - 0,5 г, танин - 8,0 г, вода дистиллированная - 50 мл. Раствор 2: насыщенный раствор алюмокалиевых квасцов. Раствор 3: насыщенный раствор генцианвиолета или кристаллвиолета. Перед употреблением растворы смешивают (5:5:3). На высушенный мазок наливают смесь растворов и нагревают до появления пара. Через 3 мин промывают и микроскопируют. Жгутики фиолетово-черного цвета.
Окраска по Валенти. Мазок обрабатывают 3 мин 20%-ным раствором танина при подогревании, промывают, окрашивают 10 мин карболовым фуксином при подогревании. Промывают, микроскопируют. Бактерии и жгутики - красного цвета.
Окраска по Грэю. Раствор А: дубильная 20%-ная водная кислота - 2 мл, насыщенный водный раствор калийных квасцов - 5 мл, хлористая ртуть, насыщенный водный раствор - 2 мл, основной фуксин 3%-ный в 96%-ном этаноле - 0,4 мл. Краситель (фуксин) добавляют к остальным ингредиентам непосредственно перед употреблением и после его растворения полученный раствор фильтруют через фильтровальную бумагу. Раствор Б: карболовый фуксин Циля (основной фуксин 3%-ный на 95%-ном этаноле - 10 мл, фенол - 5 мл, дистиллированная вода - 95 мл).
Методика. Каплю бактерий (суспензию) в формалине наносят на стекло и дают ей стечь. Высушивают на воздухе. Кладут полоску фильтровальной бумаги и на 4-6 мин наливают раствор А. Промывают водой и 3 мин окрашивают через фильтровальную бумагу раствором Б. Промывают, высушивают, микроскопируют. Жгутики и бактерии - красного цвета.
Окраска по Ляйфсону. Готовят 3 раствора. Раствор 1: 1,5%-ный раствор хлористого натрия в дистиллированной воде. Раствор 2: 3%-ный раствор дубильной кислоты в дистиллированной воде. Раствор 3: уксуснокислый розанилин - 0,9 г, солянокислый прозанилин – 0,3 г, 96%-ный этанол - 100 мл. Смешивают поровну растворы 1 и 2 и затем 2 объема этой смеси приливают к 1 объему раствора 3. Смесь сохраняется в холодильнике до 3 месяцев.
Методика. Каплю суспензии наносят на хорошо обезжиренное стекло и дают ей стечь. Высушив, очерчивают карандашом по стеклу границы пленки бактерий, на 7-15 мин площадку заливают красителем. Выдерживают до тех пор, пока поверхность красителя приобретет золотистый цвет, а пленка бактерии не будет покрыта осадком. Промывают, высушивают. Бактерии и жгутики – красного цвета.
Методы окраски клеточной стенки
Окраска клеточной стенки имеет диагностическую ценность при дифференциации микоплазм от бактерий.
Метод Гутштейна. Препарат фиксируют 1-2 часа в жидкости Буэна, выдерживают 2-3 минуты в 5-10%-ном водном растворе танина, ополаскивают водой и микроскопируют в капле 0,01%-ного водного раствора кристаллического фиолетового.
Метод Пешкова. Препарат фиксируют 15 минут в жидкости следующего состава: этанол 90%-ный – 60 мл, хлороформ - 30 мл, уксусная эссенция – 10 мл. Далее препарат выдерживают в течение 2-5 минут в 10%-ном водном растворе танина, промывают водой, красят 30-60 секунд фуксином Пфейффера и, не перемешивая, подсушивают и микроскопируют.
Метод) Робиноу. Исследуемый микроорганизм выращивают на агаровой среде в чашке Петри, вырезают агаровый блок и кладут его поверхностью на покровное стекло, помещают на ночь в жидкость Буэна. На следующий день удаляют агар, стекло отпечатком вниз кладут на поверхность 5-10%-ното водного раствора таниновой кислоты на 20-30 минут. Затем препарат промывают водой, покровное стекло клетками бактерий вниз кладут на поверхность 0,02%-ного водного раствора кристаллического фиолетового на 5-10 секунд. В итоге клеточные оболочки и перегородки окрашиваются в темно-синий или в черный цвет, а цитоплазма остается неокрашенной.
Методы окраски цитоплазматических включений
При идентификации микроорганизмов определенное значение имеют данные о наличии в клетках включений, отражающих тип и направленность конструктивного метаболизма. К цитоплазматическим включениям относят поли-бетта-оксимасляную кислоту, зерна метахроматина (волютина) и полисахариды.
Поли-бетта-оксимасляная кислота представляет собой полиэфир бетта-оксимасляной кислоты, который накапливается в цитоплазме клеток в виде округлых или овальных гранул размером 200-800 нм. Метахроматин - это полифосфаты, а полисахариды – глюканы, состоящие из D-глюкозы, размером до 200 нм. Перечисденные включения выполняют роль своеобразных запасов веществ клеток и могут быть обнаружены специальными методами окраски.
Обнаружение поли-бетта-оксимасляной кислоты
Фиксированный над пламенем горелки мазок окрашивают 5-15 мин 0,3%-ным раствором Судана черного В в этиленгликоле. Краску сливают и после высушивания на воздухе без промывания водой ополаскивают в ксилоле. Дав мазку высохнуть, опускают на 5-10 с в 0,5%-ный водный раствор сафранина. Промывают водой, высушивают и микроскопируют. Включения поли-бетта-оксимасляной кислоты видны на розовом фоне цитоплазмы в виде черно-синих образований.
Обнаружение метахроматина (волютина)
Метод Нейссера. Готовят 4 раствора. Раствор А: метиленовый синий - 0,1 г, этанол 95%-ный - 2 мл, уксусная кислота ледяная - 6 мл, вода дистиллированная- 100 мл. Раствор Б: кристаллвиолет- 1 г, этанол 95%-ный - 100 мл, вода дистиллированная - 300 мл. Раствор В йод кристаллический - 1 г, калий йодистый - 2,0 г, вода дистиллированная - 300 мл. Раствор Г: хризоидин - 1 г, вода дистиллированная- 300 мл (хризоидин растворяют в горячей воде). На фиксированный над пламенем горелки мазок на 1 мин наливают смесь раствора А и Б в соотношении 2:1 (смесь готовят перед окраской). Сливают краску, обрабатывают 1 мин раствором В (раствор Люголя) и промывают водой, высушивают, микроскопируют. Клетки бактерий светло-желтого, зерна волютина - темно-синего цвета.
Метод Раскиной. Готовят краску следующего состава: карболовый фуксин Циля - 4 мл, насыщенный спиртовой раствор метиленовой сини - 4 мл, кислота уксусная ледяная - 5 мл, этанол 96%-ный - 95 мл, вода дистиллированная -92 мл. На фиксированный над пламенем горелки мазок наливают краситель, нагревают над горелкой до сгорания спирта, промывают водой, высушивают и микроскопируют. Клетки бактерий окрашиваются в светло-красный цвет, зерна волютина - в черно-синий.
Обнаружение полисахаридов
Окраска реактивом Шиффа. Готовят 4 раствора. Раствор А (раствор периодата): 4%-ный раствор йодной кислоты - 20 мл, 0,2 М водный раствор ацетата натрия - 10 мл, 96%-ный этанол - 70 мл. Раствор чувствителен к свету, поэтому его следует хранить в темной склянке в темноте.
На препарат последовательно наносят красители различные по химическому составу и цвету, что позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать микроорганизмы.
Метод Грамма р азработан датским ученым Х. Грамом в 1884 году. Он позволяет выявить структуры клеточных стенок и химические особенности бактерий. Грамположительно в фиолетовый цвет окрашиваются бактерии, у которых клеточная стенка содержит много слоев пептидогликана, соединенного поперечными мостиками в плотный чехол. Кроме того, в цитоплазме содержатся магниевые соли РНК, изоэлектрическая точка рН 2-3. Комплекс генцианвиолета и йода у этих бактерий образует химическое соединение с магниевыми солями рибонуклеиновой кислоты, которое не разрушается спиртом и не проходит через плотную клеточную стенку, поэтому цитоплазма бактерий окрашивается в фиолетовый цвет. Примеры грамположительных бактерий - стафилококки, стрептококки, микобактерии, возбудитель дифтерии и др. У грамотрицательных бактерий комплекс генцианвиолета с йодом обесцвечивается этанолом и легко выходит через клеточную стенку, имеющую тонкий слой пептидогликана, покрытого наружной плазматической мембраной, которая содержит липополисахариды и липопротеиды. Белки внешней мембраны являются поринами, через которые могут проникать гидрофильные молекулы величиной до 6000 Да, поэтому грамотрицательные бактерии не окрашиваются генцианвиолетом, а воспринимают дополнительную окраску фуксином. Например: менингококки, гонококки, кишечная палочка, холерный вибрион и др.
Техника окраски
1. Препарат залить генцианвиолетом – 3-4 мин.
2. затем раствором люголя – 2 мин.
3. обесцветить спиртом – 15-20 сек.
4. Промыть водой.
5. докрасить фуксином водным 2-3 мин.
6. Смыть краску водой, препарат просушить фильтровальной бумагой.
Метод Бурри-Гинса применяется для обнаружения капсул.
Капсулы представляют собой наружный слизистый слой клеточной стенки бактерий, состоящий из полисахаридов или пептидов с содержанием большого количества воды, поэтому капсула не окрашивается анилиновыми красителями. Для выявления капсулы по методу Бурри-Гинса культуру бактерий смешивают на предметном стекле с тушью, мазок высушивают, фиксируют и докрашивают обычным фуксином. При этом на черном фоне капсулы видны светлыми ореолами вокруг розовых бактерий. Например: пневмококки, возбудитель чумы, сибирской язвы и др.
Техника приготовления препарата.
На предметное стекло наносят каплю культуры и каплю туши, смешивают их краем шлифованного предметного стекла и делают препарат по типу мазка крови, затем высушивают, фиксируют и докрашивают две минуты водным фуксином.
Метод Циля-Нильсена применяется для выявления бактерий и спор, обладающих кислотоустойчивостью. Кислотоустойчивые микроорганизмы не окрашиваются простыми методами, так как содержат в клеточной стенке до 40% жировосковых веществ и фосфолипидов. Поэтому препараты сначала протравливают кислотой (метод Ожешка) и окрашивают при подогревании краски основным карболовым фуксином Циля (метод Циля-Нильсена). Затем препарат обесцвечивают серной кислотой и докрашивают метиленовой синькой. При этом кислотоустойчивые бактерии и споры окрашиваются в красный цвет, некислотоустойчивые элементы и бактерии - в синий.
Техника окраски.
1. На фиксированный препарат нанести раствор основного фуксина через кусочек фильтровальной бумаги, подогреть краску до появления пара 3-5 мин.
2. Снять фильтровальную бумажку, нанести 3-5% раствор серной кислоты - 20-30 сек. и смыть водой.
3. Докрасить препарат водной метиленовой синькой – 3-5 мин.
1. Клеточная стенка у грамположительных бактерий имеет:
1. много слоев пептидогликана.
2. наружную плазматическую мембрану.
3. в основном полисахариды.
2. Грамположительные бактерии - это:
1. менингококки.
2. стрептококки
3. стафилококки
4. кишечная палочка.
5. микобактерии туберкулеза.
3. Для выявления капсулы применяют методы окраски:
1. по Граму.
2. по Цилю-Нильсену.
3. простую окраску фуксином.
4. метод Бурри-Гинса.
Самостоятельная лабораторная работа студентов.
1. Приготовление мазка из смеси E.Coli и Staphylococus albus.
Окраска по Граму. Записать процесс окраски грамположительных и грамотрицательных бактерий.
2. Определение подвижности E.Coli.
3. Просмотреть демонстрационные препараты:
а) споры В.anthraсoides, окрашенные по методу Циля-Нильсена
б) капсулы В.Friedlanderi, выявленные по Бурри-Гинсу
в) препарат Neisseriae gonorrhoeae грамотрицательный.
Г) препарат Corynebacterium diphtheriae грамположительный.
4. Зарисовать все препараты цветными карандашами, указать латинские названия микробов
5. Получить подпись преподавателя под протоколом.
Методы окраски. Окраску мазка производят простыми или сложными методами. Простые заключаются в окраске препарата одним красителем; сложные методы (по Граму, Цилю - Нильсену и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и имеют дифференциально-диагностическое значение. Отношение микроорганизмов к красителям расценивают как тинкториальные свойства. Существуют специальные методы окраски, которые используют для выявления жгутиков, клеточной стенки, нуклеоида и разных цитоплазматических включений.
При простых методах мазок окрашивают каким-либо одним красителем, используя красители анилинового ряда (основные или кислые). Если красящий ион (хромофор) - катион, то краситель обладает основными свойствами, если хромофор - анион, то краситель имеет кислые свойства. Кислые красители - эритрозин, кислый фуксин, эозин. Основные красители - генциановый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, метиленовый синий, основной фуксин. Преимущественно для окраски микроорганизмов используют основные красители, которые более интенсивно связываются кислыми компонентами клетки. Из сухих красителей, продающихся в виде порошков, готовят насыщенные спиртовые растворы, а из них - водно-спиртовые, которые и служат для окрашивания микробных клеток. Микроорганизмы окрашивают, наливая краситель на поверхность мазка на определенное время. Окраску основным фуксином ведут в течение 2 мин, метиленовым синим - 5-7 мин. Затем мазок промывают водой до тех пор, пока стекающие струи воды не станут бесцветными, высушивают осторожным промоканием фильтровальной бумагой и микроскопируют в иммерсионной системе. Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения совершенно прозрачно, а клетки интенсивно окрашены.
Сложные методы окраски применяют для изучения структуры клетки и дифференциации микроорганизмов. Окрашенные мазки микроскопируют в иммерсионной системе. Последовательно нанести на препарат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету, протравы, спирты, кислоту и др.
Существуют несколько основных окрасок: по Граму, по Цилю-Нельсону, по Ауески, Нейссера, Бури-Гинса.
Механизм и этапы окраски по Граму
1. На фиксированный мазок нанести карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 1-2 мин снять ее, а краситель слить.
2. Нанести раствор люголя на 1-2 мин (йод)
3. Обесцветить этиловым спиртом в течении 30-60 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.
4. Промыть водой
5. Докрасить водным р-ом фуксина в течении 1-2 мин, промыть водой, высушить и микроскопировать.
* Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные - в красный.
Механизм и этапы окраски по Цилю-Нельсону
1. На фиксированный мазок нанести карболовый р-р фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогреть до появления паров в течении 3-5 мин
2. Снять бумагу, провыть мазок водой
3. Нанести 5% р-р серной кислоты или 3% р-р смеси спирта с хлороводородной кислотой на 1-2 мин для обесцвечивания.
4. Промыть водой
5. Докрасить мазок водным р-ом метиленового синего в течении 3-5 мин
6. Промыть водой, высушить и микроскопировать
* Некислоустойчивые – обесцвечиваются и окр. метиленовым синим в голубой цвет, а кислоустойчивые остаются окрашенными фуксином в красный.
Возбудитель чумы
Возбудитель – Yersinia pestis. грамотрицательные палочки, овоидной формы, окрашиваются биполярно. Подвижны, имеют капсулу, спор не образуют Факультативные анаэробы. Хорошо культивируются на простых питательных средах. Ферментируют большинство углеводов без образования газа. Два типа колоний - молодые и зрелые. Молодые с неровными краями. Зрелые колонии крупные, с бурым зернистым центром и неровными краями.
Биохимические свойства: фенментативная активнсть высокая: ферментация до кислоты ксилозу, синтез плазмокоагулазы, фибринолизина, гемолизина, лецитиназу, сероводород. чувствителен к антибиотикам нестоек к окружающей среде при высокой температуре.
Клинические особенности: Инкубационный период – несколько часов до 8 сут. Различают локальные – кожно-бубонная, бубонная; внешне-диссеминированные – первично-легочная, вторично-легочная и кишечная; генерализованная – первично-септическая, вторично-септическая формы чумы. Региональная лимфоаденопатия, энтероколиты, реактивные артриты, спондилит, лихорадка.
Эпидемиология: Чума - классический природноочаговый зооноз диких животных. Основные носители в природе - сурки, суслики, в городских условиях - крысы. В передаче возбудителя - блохи животных, способные заражать человека.
Иммунитет: клеточно-гуморальный, ограничен по длительности
Микробиологическая диагностика:
Бактериоскопическое исследование. Из исследуемого материала готовят мазки, окрашивают по Граму и водным раствором метиленового синего. Бактерии чумы представляют собой грамотрицательные палочки овоидной формы Бактериологическое исследование. Исследуемый материал засевают на чашки с питательным агаром. На бульоне бактерии образуют пленку; ферментируют многие сахара до кислоты, индола не образуют, желатин не разжижают.
Биопроба. Проводится для выделения чистой культуры из материала, загрязненного посторонней микрофлорой.
Экспресс-методы лабораторной диагностики:
2.РПГА - для обнаружения антигенов бактерий в материале с помощью стандартной противочумной сыворотки, антитела которой нагружены на эритроциты.
Лечение: антибиотики Профилактика: специфическая профилактика - живая ослабленная чумная вакцина EV.
Чумной бактериофаг – при идентификации Y.pestis.
Чумная сухая вакцина – высушенная живая культура Y.pestis вакцинного штамма EV, используется для профилактики чумы.