Kolik chromatogramů je potřeba k implementaci techniky HPLC. Cvičení: Vysokoúčinná kapalinová chromatografie přírodních a odpadních vod polutantů
"Vysoce účinná kapalinová chromatografie přírodních a odpadní voda»
Úvod
Kapitola 1. Základní pojmy a klasifikace metod kapalinové chromatografie
1.1 Zařízení pro kapalinovou chromatografii
Kapitola 2. Podstata HPLC
2.1 Aplikace
Kapitola 3. Příklady použití HPLC při analýze objektů životní prostředí
Kapitola 4 Přístrojové vybavení HPLC
Literatura
aplikace
Úvod
Chromatografické metodyčasto nepostradatelné pro identifikaci a kvantifikaci organická hmota s podobnou strukturou. Nejpoužívanější pro rutinní analýzu látek znečišťujících životní prostředí jsou plynová a vysokoúčinná kapalinová chromatografie. Plynová chromatografická analýza organických polutantů v pitných a odpadních vodách byla zpočátku založena na použití plněných kolon, později se rozšířily i křemenné kapilární kolony. Vnitřní průměr kapilárních kolon je obvykle 0,20-0,75 mm, délka - 30-105 m. Optimálních výsledků při analýze kontaminantů ve vodě se nejčastěji dosahuje při použití kapilárních kolon s různou tloušťkou filmu z methylfenylsilikonů s obsahem fenyl skupiny 5 a 50 %. Systém vstřikování vzorku se často stává zranitelným místem v chromatografických technikách využívajících kapilární kolony. Systémy vstřikování vzorků lze rozdělit do dvou skupin: univerzální a selektivní. Mezi univerzální patří vstřikovací systémy s a bez dělení toku, „studené“ vstřikování do kolony a odpařování s programováním teploty. Selektivní vstřikování využívá čištění s přechodným zachycováním, analýzou headspace atd. Při použití univerzálních vstřikovacích systémů se do kolony dostává celý vzorek, při selektivním nástřiku se zavádí pouze určitá frakce. Výsledky získané selektivním vstřikováním jsou výrazně přesnější, protože frakce, která vstoupila do kolony, obsahuje pouze těkavé látky a techniku lze plně automatizovat.
Plynové chromatografické detektory používané při monitorování znečišťujících látek se často dělí na univerzální detektory, které reagují na každou složku v mobilní fázi, a selektivní detektory, které reagují na přítomnost určité skupiny látek v mobilní fázi s podobným chemické vlastnosti. Mezi ty univerzální patří plamenová ionizace, atomová emise, hmotnostní spektrometrické detektory a infračervená spektrometrie. Selektivní detektory používané při analýze vody jsou elektronové záchytné (selektivní pro látky obsahující atomy halogenu), termionické (selektivní pro sloučeniny obsahující dusík a fosfor), fotoionizační (selektivní pro aromatické uhlovodíky), detektor elektrolytické vodivosti (selektivní pro sloučeniny, obsahující halogen atomy síry a dusíku). Minimální detekovatelné množství látek se pohybuje od nanogramů po pikogramy za sekundu.
Vysoce výkonná kapalinová chromatografie(HPLC) je ideální metodou pro stanovení velký počet tepelně nestabilní sloučeniny, které nelze analyzovat pomocí plynové chromatografie. V současné době se moderní agrochemikálie, včetně methylkarbonátů a organofosforových insekticidů a dalších netěkavých látek, často stávají předmětem analýzy kapalinovou chromatografií. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) se prosazuje mezi ostatními metodami používanými při monitorování životního prostředí také proto, že má světlé vyhlídky z hlediska automatizace přípravy vzorků.
KAPITOLA 1. ZÁKLADNÍ POJMY A KLASIFIKACE METOD KAPALINOVÉ CHROMATOGRAFIE
Kapalinová chromatografie se dělí do několika tříd v závislosti na typu nosiče stacionární fáze. Jednoduché přístrojové vybavení papírové a tenkovrstvé chromatografie vedlo k širokému použití těchto metod v analytické praxi. Velké možnosti kolonové kapalinové chromatografie však podnítily zdokonalení zařízení pro tuto klasickou metodu a vedly k rychlému zavedení HPLC. Průchod eluentu kolonou pod vysokým tlakem umožnil prudce zvýšit rychlost analýzy a výrazně zvýšit účinnost separace díky použití jemně dispergovaného sorbentu. Metoda HPLC v současné době umožňuje izolovat, kvantitativně a kvalitativně analyzovat složité směsi organických sloučenin.
Podle mechanismu interakce separované látky (eluátu) se stacionární fází se rozlišuje adsorpční, distribuční, iontově výměnná, velikostně vylučovací, iontově-párová, ligandově výměnná a afinitní chromatografie.
Adsorpční chromatografie. Separace adsorpční chromatografií se provádí jako výsledek interakce separované látky s adsorbentem, jako je oxid hlinitý nebo silikagel, které mají na povrchu aktivní polární centra. Rozpouštědlo (eluent) je nepolární kapalina. Mechanismus sorpce spočívá ve specifické interakci mezi polárním povrchem sorbentu a polárními (nebo polarizovatelnými) oblastmi molekul analyzované složky (obr. 1).
Rýže. 1. Adsorpční kapalinová chromatografie.
Rozdělovací chromatografie. V distributivní verzi kapalinové chromatografie se separace směsi látek provádí z důvodu rozdílu jejich distribučních koeficientů mezi dvěma nemísitelnými fázemi - eluentem (mobilní fáze) a fází umístěnou na sorbentu (stacionární fáze).
V normální fáze Dělicí kapalinová chromatografie využívá nepolární eluent a polární skupiny naroubované na povrch sorbentu (nejčastěji silikagelu). Jako povrchové modifikátory silikagelu (vázané fáze) se používají substituované alkylchlorsilany obsahující polární skupiny, jako je nitril, aminoskupina atd. (obr. 2). Použití vázaných fází umožňuje jemně řídit sorpční vlastnosti povrchu stacionární fáze a dosáhnout vysoké separační účinnosti.
Rýže. 2. Dělicí chromatografie s vázanou fází (varianta normální fáze).
obrácená fáze kapalinová chromatografie je založena na distribuci složek směsi mezi polární eluent a nepolární skupiny (dlouhé alkylové řetězce) naroubované na povrch sorbentu (obr. 3).
Rýže. 3. Dělicí chromatografie s navázanou fází (verze s reverzní fází).
Méně rozšířená je varianta kapalinové chromatografie na nosiči, při které je kapalná stacionární fáze aplikována na stacionární nosič.
Exkluzivní (gel penetrující) Chromatografie je varianta kapalinové chromatografie, při které k separaci látek dochází díky distribuci molekul mezi rozpouštědlem umístěným v pórech sorbentu a rozpouštědlem proudícím mezi jeho částicemi.
afinní Chromatografie je založena na specifických interakcích separovaných proteinů (protilátek) s látkami (antigeny) naroubovanými na povrch sorbentu (syntetické pryskyřice), které selektivně tvoří komplexy (konjugáty) s proteiny.
Iontově výměnná chromatografie, iontově-párová a ligandová výměnná chromatografie se používají hlavně v anorganické analýze.
Základní parametry chromatografické separace.
Hlavními parametry chromatografické separace jsou retenční objem a retenční čas složky směsi (obr. 4).
Retenční čas tR je doba, která uplynula od okamžiku nástřiku vzorku do kolony do dosažení maxima odpovídajícího píku. Vynásobením retenčního času objemovou rychlostí eluentu F získáme retenční objem VR:
Korigovaný retenční čas je čas, který uplynul od okamžiku, kdy se objeví pík nesorbovatelné složky, do píku odpovídající sloučeniny:
tR" = tR - t0 ;
Normalizovaný nebo korigovaný retenční objem je retenční objem korigovaný na mrtvý objem kolony V0, tj. retenční objem nesorbovatelné složky:
VR" = VR - V0;
Retenční charakteristikou je také kapacitní faktor k", definovaný jako poměr hmotnosti látky ve stacionární fázi k hmotnosti látky v mobilní fázi: k" = mn / mp;
Hodnotu k" lze snadno určit z chromatogramu:
Nejdůležitější parametry chromatografické separace jsou její účinnost a selektivita.
Účinnost kolony, měřená výškou teoretických pater (HETP) a nepřímo úměrná jejich počtu (N), je tím vyšší, čím užší je pík látky vznikající při stejném retenčním čase. Hodnotu účinnosti lze vypočítat z chromatogramu pomocí následujícího vzorce:
N = 5,54. (tR / 1/2) 2,
kde tR- doba držení,
w 1/2 - šířka píku v polovině výšky
Při znalosti počtu teoretických pater na kolonu, délce kolony L a průměrného průměru zrna sorbentu dc je snadné získat hodnoty teoretické ekvivalentní výšky pater (HETP) a snížené výšky (PETP):
HETP = L/N PHETP = HETP/d c
Tyto charakteristiky umožňují porovnávat účinnost kolon různých typů, hodnotit kvalitu sorbentu a kvalitu plnění kolon.
Selektivita separace dvou látek je určena rovnicí:
Při zvažování separace směsi dvou složek je důležitým parametrem také stupeň separace RS:
;
Píky se považují za vyřešené, pokud je hodnota RS větší nebo rovna 1,5.
Hlavní chromatografické parametry souvisí s následující rovnicí pro rozlišení:
;
Faktory, které určují selektivitu separace, jsou:
1) chemická povaha sorbentu;
2) složení rozpouštědla a jeho modifikátorů;
3) chemická struktura a vlastnosti složek směsi, která má být separována;
4) teplota kolony
1.1 Zařízení pro kapalinovou chromatografii
V moderní kapalinové chromatografii se používají přístroje různého stupně složitosti – od nejjednodušších systémů až po špičkové chromatografy vybavené různými přídavnými zařízeními.
Na Obr. Obrázek 4 ukazuje blokové schéma kapalinového chromatografu obsahujícího minimální požadovanou sadu komponent, v té či oné formě, přítomných v jakémkoli chromatografickém systému.
Rýže. 4. Blokové schéma kapalinového chromatografu.
Čerpadlo (2) je navrženo tak, aby vytvářelo konstantní průtok rozpouštědla. Jeho návrh je dán především provozním tlakem v systému. Pro provoz v rozsahu 10-500 MPa se používají čerpadla plunžrová (stříkačka) nebo pístová. Nevýhodou prvního je nutnost periodických zastávek pro plnění eluentem a druhým je velká složitost konstrukce a ve výsledku vysoká cena. Pro jednoduché systémy s nízkými provozními tlaky 1-5 MPa se úspěšně používají levná peristaltická čerpadla, ale protože je obtížné dosáhnout konstantního tlaku a průtoku, je jejich použití omezeno na přípravné úkoly.
Injektor (3) zajišťuje, že vzorek směsi separovaných složek je vstřikován do kolony s dostatečně vysokou reprodukovatelností. Jednoduché systémy vstřikování vzorků „stop-flow“ vyžadují zastavení čerpadla a jsou proto méně pohodlné než smyčkové pipety Reodyne.
HPLC kolony (4) jsou silnostěnné trubky z nerezové oceli schopné odolat vysokému tlaku. Důležitou roli hraje hustota a rovnoměrnost naplnění kolony sorbentem. Pro nízkotlakou kapalinovou chromatografii se úspěšně používají tlustostěnné skleněné kolony. Stálost teploty zajišťuje termostat (5).
Detektory (6) pro kapalinovou chromatografii mají průtokovou kyvetu, ve které se kontinuálně měří některá vlastnost protékajícího eluentu. Nejoblíbenějšími typy detektorů pro všeobecné použití jsou refraktometry, které měří index lomu, a spektrofotometrické detektory, které měří absorbanci rozpouštědla při pevné vlnové délce (obvykle v ultrafialové oblasti). Mezi výhody refraktometrů (a nevýhody spektrofotometrů) patří nízká citlivost na typ stanovované sloučeniny, která nemusí obsahovat chromoforové skupiny. Na druhou stranu je použití refraktometrů omezeno na izokratické systémy (s konstantním složením eluentu), takže použití gradientu rozpouštědla v tomto případě není možné.
HPLC kolony, které se nejčastěji používají při analýze látek znečišťujících životní prostředí, jsou 25 cm dlouhé a 4,6 mm vnitřní průměr a jsou naplněny 5-10 µm sférickými částicemi silikagelu roubovanými oktadecylovými skupinami. V minulé roky objevily se kolony s menším vnitřním průměrem, naplněné menšími částicemi. Použití takových kolon snižuje spotřebu rozpouštědel a dobu trvání analýzy, zvyšuje citlivost a účinnost separace a také usnadňuje problém připojení kolon ke spektrálním detektorům. Kolony s vnitřním průměrem 3,1 mm jsou vybaveny bezpečnostní patronou (předkolonou) pro zvýšení životnosti a zlepšení reprodukovatelnosti analýz.
Jako detektory v moderních HPLC přístrojích se obvykle používá UV detektor na diodovém poli, fluorescenční a elektrochemické detektory.
Je třeba mít na paměti, že v praktické práci separace často neprobíhá jedním, ale několika mechanismy současně. Vylučovací separace tedy může být komplikována adsorpčními efekty, adsorpcí - distribucí a naopak. V tomto případě platí, že čím větší je rozdíl v látkách ve vzorku z hlediska stupně ionizace, zásaditosti nebo kyselosti, z hlediska molekulové hmotnosti, polarizace a dalších parametrů, tím větší je pravděpodobnost odlišného separačního mechanismu těchto látek. .
V praxi se nejvíce rozšířila „reverzní“ (partiční) chromatografie, kdy stacionární fáze není polární, ale mobilní fáze je polární (tj. obrácená chromatografie s „přímou fází“).
Ve většině laboratoří po celém světě je skupina 16 prioritních PAH analyzována pomocí HPLC nebo CMS.
KAPITOLA 2. PODSTATA HPLC
Ve vysoce výkonné kapalinové chromatografii (HPLC) je povaha procesů probíhajících v chromatografické koloně obecně identická s procesy v plynové chromatografii. Rozdíl je pouze v použití kapaliny jako stacionární fáze. Vzhledem k vysoké hustotě kapalných mobilních fází a vysoké odolnosti kolon se plynová a kapalinová chromatografie značně liší v instrumentaci.
V HPLC se jako mobilní fáze obvykle používají čistá rozpouštědla nebo jejich směsi.
K vytvoření proudu čistého rozpouštědla (nebo směsí rozpouštědel), v kapalinové chromatografii nazývaného eluent, se používají čerpadla, která jsou součástí hydraulického systému chromatografu.
Adsorpční chromatografie se provádí jako výsledek interakce látky s adsorbenty, jako je silikagel nebo oxid hlinitý, které mají na povrchu aktivní centra. Rozdíl ve schopnosti interagovat s adsorpčními centry různých molekul vzorku vede k jejich separaci do zón v procesu pohybu s mobilní fází kolonou. Dosažené rozdělení zón složek v tomto případě závisí na interakci jak s rozpouštědlem, tak s adsorbentem.
Silikagelové adsorbenty s různými objemy, povrchy a průměry pórů nacházejí největší uplatnění v HPLC. Oxid hlinitý a další adsorbenty se používají mnohem méně často. Hlavní důvod:
Nedostatečná mechanická pevnost, která neumožňuje balení a použití při zvýšených tlacích typických pro HPLC;
silikagel má ve srovnání s oxidem hlinitým širší rozsah poréznosti, povrchu a průměru pórů; výrazně vyšší katalytická aktivita oxidu hlinitého vede ke zkreslení výsledků analýzy v důsledku rozkladu složek vzorku nebo jejich nevratné chemisorpce.
HPLC detektory
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) se používá k detekci polárních netěkavých látek, které z nějakého důvodu nelze převést do formy vhodné pro plynovou chromatografii, a to ani ve formě derivátů. Mezi takové látky patří zejména sulfonové kyseliny, ve vodě rozpustná barviva a některé pesticidy, jako jsou deriváty fenylmočoviny.
Detektory:
UV - diodový detektor pole. „Matrice“ fotodiod (je jich více než dvě stě) neustále registruje signály v UV a viditelné oblasti spektra a zajišťuje tak záznam UV-B spekter v režimu skenování. To umožňuje kontinuálně zaznamenávat při vysoké citlivosti nezkreslená spektra složek rychle procházejících speciální celou.
Ve srovnání s detekcí na jedné vlnové délce, která neposkytuje informaci o „čistotě“ píku, poskytuje možnost porovnat celá spektra diodového pole výsledek identifikace s mnohem větší mírou jistoty.
Fluorescenční detektor. Velká obliba fluorescenčních detektorů je dána velmi vysokou selektivitou a citlivostí a tím, že mnoho látek znečišťujících životní prostředí fluoreskuje (například polyaromatické uhlovodíky).
Elektrochemický detektor se používá k detekci látek, které se snadno oxidují nebo redukují: fenoly, merkaptany, aminy, aromatické nitro a halogenderiváty, aldehydy, ketony, benzidiny.
Chromatografická separace směsi na koloně v důsledku pomalého postupu PF trvá dlouho. Pro urychlení procesu se chromatografie provádí pod tlakem. Tato metoda se nazývá vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC).
Modernizace zařízení používaného v klasické kapalinové kolonové chromatografii z ní učinila jednu ze slibných a moderních metod analýzy. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie je vhodná metoda pro separaci, preparativní izolaci a provádění kvalitativní a kvantitativní analýzy netěkavých termolabilních sloučenin jak s nízkou, tak s vysokou molekulovou hmotností.
V závislosti na typu použitého sorbentu při této metodě se používají 2 varianty chromatografie: na polárním sorbentu s nepolárním eluentem (možnost přímé fáze) a na nepolárním sorbentu s polárním eluentem - tzv. reverzní -fázová vysokoúčinná kapalinová chromatografie (RPHLC).
Při přechodu eluentu do eluentu se rovnováha za podmínek RPHLC ustaví mnohonásobně rychleji než za podmínek polárních sorbentů a nevodných PF. V důsledku toho, stejně jako pohodlí práce s vodou a voda-alkohol eluenty, RPHLC nyní získal velkou popularitu. Většina analýz HPLC se provádí pomocí této metody.
Detektory. Registrace výstupu z kolony samostatné složky se provádí pomocí detektoru. Pro registraci můžete využít změnu libovolného analytického signálu pocházejícího z mobilní fáze a souvisejícího s povahou a množstvím složky směsi. Kapalinová chromatografie využívá takové analytické signály, jako je absorpce světla nebo emise světla vystupujícího roztoku (fotometrické a fluorimetrické detektory), index lomu (refraktometrické detektory), potenciál a elektrická vodivost (elektrochemické detektory) atd.
Průběžně detekovaný signál zaznamenává rekordér. Chromatogram je posloupnost signálů detektoru zaznamenaných na záznamové pásce, generovaných při výstupu jednotlivých složek směsi z kolony. V případě separace směsi jsou na vnějším chromatogramu viditelné jednotlivé píky. Poloha píku na chromatogramu se používá pro účely identifikace látky, výška nebo plocha píku - pro účely kvantitativního stanovení.
2.1 Aplikace
HPLC nachází nejširší uplatnění v následujících oblastech chemické analýzy (zvýrazněny jsou objekty analýzy, kde HPLC prakticky nemá konkurenci):
· Kontrola kvality potravin - posilující a chuťové přísady, aldehydy, ketony, vitamíny, cukry, barviva, konzervanty, hormony, antibiotika, triaziny, karbamáty a další pesticidy, mykotoxiny, nitrosoaminy, polycyklické aromatické uhlovodíky atd.
· Ochrana životního prostředí - fenoly, organické nitrosloučeniny, mono- a polycyklické aromatické uhlovodíky, řada pesticidů, hlavní anionty a kationty.
· Kriminalistika - drogy, organické výbušniny a barviva, silná léčiva.
· Farmaceutický průmysl - steroidní hormony, prakticky všechny produkty organické syntézy, antibiotika, polymerní přípravky, vitamíny, proteinové přípravky.
Medicína - uvedené biochemické a léčivé látky a jejich metabolity v biologických tekutinách (aminokyseliny, puriny a pyrimidiny, steroidní hormony, lipidy) v diagnostice nemocí, stanovení rychlosti vylučování léčiv z organismu za účelem jejich individuálního dávkování .
· Zemědělství- stanovení dusičnanů a fosforečnanů v půdách pro stanovení potřebného množství aplikovaných hnojiv, stanovení nutriční hodnoty krmiv (aminokyseliny a vitamíny), rozbory pesticidů v půdě, vodě a zemědělských produktech.
Biochemie, bioorganická chemie, genetické inženýrství, biotechnologie - cukry, lipidy, steroidy, proteiny, aminokyseliny, nukleosidy a jejich deriváty, vitamíny, peptidy, oligonukleotidy, porfyriny atd.
· Organická chemie - všechny stabilní produkty organické syntézy, barviva, termolabilní sloučeniny, netěkavé sloučeniny; anorganická chemie (prakticky všechny rozpustné sloučeniny ve formě iontů a komplexních sloučenin).
· Kontrola kvality a bezpečnosti potravinářských výrobků, alkoholických a nealkoholických nápojů, pitné vody, domácí chemie, parfémů ve všech fázích jejich výroby;
určení povahy znečištění v místě člověkem způsobené katastrofy nebo mimořádné události;
detekce a analýza omamných, silných, jedovatých a výbušniny;
určení přítomnosti škodlivé látky(polycyklické a jiné aromatické uhlovodíky, fenoly, pesticidy, organická barviva, těžké ionty alkalických kovů a kovů alkalických zemin) v kapalných odpadních vodách, emisích do ovzduší a pevných odpadech z podniků a v živých organismech;
· sledování procesů organické syntézy, zpracování ropy a uhlí, biochemické a mikrobiologické výroby;
analýza kvality půdy pro hnojení, přítomnost pesticidů a herbicidů v půdě, vodě a produktech, jakož i nutriční hodnoty krmiv; komplexní výzkumné analytické úkoly; získání mikromnožství ultračisté látky.
KAPITOLA 3. PŘÍKLADY VYUŽITÍ HPLC PŘI ANALÝZE OBJEKTŮ ŽIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ
HPLC - metoda monitorování PAH v objektech životního prostředí
Pro polycyklické aromatické uhlovodíky (PAH), ekotoxické látky 1. třídy nebezpečnosti, byly stanoveny extrémně nízké úrovně maximálních přípustných koncentrací (MAC). přírodní objekty. Stanovení PAH na úrovni MPC a nižší je jednou z velmi složitých analytických úloh a k jejich řešení se používají high-tech analytické metody (GC-MS, GC, HPLC). Při výběru metody pro sledování se kromě hlavních uvažovaných charakteristik - citlivosti a selektivity, exprese a hospodárnosti přidávají, protože. monitorování zahrnuje sériovou analýzu. HPLC varianta na krátkých kolonách malého průměru v do značné míry splňuje stanovené požadavky. Pomocí této metody autoři vyvinuli a certifikovali metody monitorování benzo[a]pyrenu ve třech přírodních prostředích: aerosol, sněhová pokrývka a povrchové vody. Metody se vyznačují: jednoduchou unifikovanou přípravou vzorku včetně extrakce PAH organickými rozpouštědly a zahuštěním extraktu, přímým zavedením koncentrovaného extraktu do chromatografické kolony, využitím vícevlnné fotometrické detekce v UV oblasti spektra, identifikace píků PAH v chromatogramech za použití dvou parametrů, retenčního času a spektrálního poměru. Celková chyba nepřesahuje 10 % při stanovení benz[a]pyrenu v aerosolu v rozmezí koncentrací od 0,3 do 450 ng/m až do 50 μg/m 2. Pro případ současného stanovení prioritních PAH (až 12 sloučenin) a registrace nehomogenních píků analytů bylo navrženo reseparovat extrakt se změnou selektivity mobilní fáze, vlnové délky detekce a teploty kolony. s přihlédnutím k jednotlivým vlastnostem stanovovaných PAU.
1 . Kvalita okolního vzduchu. Hmotnostní koncentrace benzo[a]pyrenu. Postup provádění měření metodou HPLC. Osvědčení o atestaci MVI č. 01-2000.
2 . Kvalita povrchových a čištěných odpadních vod. Hmotnostní koncentrace benzo[a]pyrenu. Postup provádění měření metodou HPLC. Osvědčení o atestaci MVI č. 01-2001.
3 . Kvalita sněhové pokrývky. Hmotnostní koncentrace benzo[a]pyrenu. Postup provádění měření metodou HPLC. Osvědčení o atestaci MVI č. 02-2001.
Odstranění anilinu z vodných roztoků pomocí odpadů z aluminotermické regenerace válcovaných měděných okují
Problém odstraňování uhlovodíků z odpadních vod je naléhavým úkolem. V mnoha chemických, petrochemických a jiných průmyslových odvětvích vzniká anilin a jeho deriváty, což jsou toxické látky. Anilin je vysoce toxická látka, MPC - 0,1 mg/m3. Anilin a jeho deriváty jsou rozpustné ve vodě, a proto je nelze odstranit gravitačním usazováním.
Jednou z nejlepších metod čištění odpadních vod od organických polutantů je použití anorganických a organických adsorbentů schopných regenerace (hlinitosilikáty, modifikované jíly, dřevo, vlákna atd.) a neschopných regenerace (aktivní uhlí, makroporézní polymerní materiály atd.) .).
Regenerované adsorbenty mohou z vody odstranit organické látky různé polarity. Hledání účinných adsorbentů je naléhavým úkolem.
Tato zpráva předkládá výsledky studie v oblasti použití mletých měděných okují z Jerevanské kabelárny (OPMOERKZ) jako anilinových sorbentů.
Chromatografické studie byly provedeny na HPLC chromatografu / vysokoúčinné kapalinové chromatografii / systémech (Waters 486 - detektor, Waters 600S - kontrolér, Waters 626 - Pump), na koloně 250 x 4 mm naplněné studovanými sorbenty, rychlost mobilní fáze 1 ml/m / mobilní fáze jsou rozpouštědla, která studujeme/, detektor je UV-254. UV spektroskopická analýza byla provedena na spektrofotometru Specord-50, spektra byla získána pomocí počítačového programu ASPECT PLUS.
K určitým objemům anilinu ve vodě byly přidány přesně odvážené dávky sorbentů, jejichž počáteční koncentrace se měnily. Směs byla důkladně protřepávána po dobu 6 h. Poté byl vzorek ponechán usadit. Adsorpce je ukončena za téměř 48 hod. Množství vysráženého anilinu bylo stanoveno UV spektrofotometrickou i refrakční analýzou.
Nejprve byly studovány adsorpční vlastnosti OPMOEPKZ při odstraňování anilinu z roztoku v tetrachlormethanu. Ukázalo se, že anilin absorbuje sorbent 3 nejlépe ze všech (tabulka).
Měření byla také provedena pro vodné roztoky anilinu v koncentracích 0,01-0,0001 mol/l. Tabulka ukazuje údaje o 0,01 M roztoku.
Absorpce anilinu různými sorbenty z 0,01 M vodného roztoku anilinu při 20°C
Dříve bylo zjištěno, že adsorpce v uvedených koncentračních rozmezích se zvyšuje a závisí lineárně na indexu lomu. Množství anilinu bylo stanoveno z grafu indexu lomu versus molární koncentrace a korigováno jak pro kapalinovou chromatografii, tak pro UV spektrální analýzu.
Pro vodné roztoky je nejaktivnější sorbent 3. Množství adsorbované polutantu bylo vypočteno jako rozdíl mezi celkovým množstvím polutantu přidaného do výchozího roztoku a jeho zbytkem ve finálním roztoku.
Metody stanovení PAU v objektech životního prostředí
Ke stanovení PAH se obvykle používají metody plynové chromatografie (GC) a vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). separace hlavních 16 PAH dostatečné pro kvantitativní analýzu je dosaženo buď pomocí kapilárních kolon v plynové chromatografii, nebo pomocí vysokovýkonných kolon používaných v HPLC. Je třeba mít na paměti, že kolona, která dobře separuje kalibrační směsi šestnácti PAH, nezaručuje, že budou také dobře separovány na pozadí doprovodných organických sloučenin ve zkoumaných vzorcích.
Za účelem zjednodušení analýzy, jakož i dosažení Vysoká kvalita získaných výsledků většina analytických postupů obsahuje fázi předběžné izolace (separace) PAU od ostatních skupin příbuzných látek ve vzorcích. Nejčastěji používanými metodami pro tento účel je nízkotlaká kapalinová chromatografie v systémech kapalina-pevná látka nebo kapalina-kapalina využívající adsorpční mechanismy, například pomocí silikagelu nebo oxidu hlinitého, někdy se používají smíšené mechanismy, například adsorpce a exkluze pomocí Sephadexu .
Použití předúpravy vzorků umožňuje vyhnout se vlivu:
Zcela nepolární sloučeniny, jako jsou alifatické uhlovodíky;
Středně a silně polární sloučeniny, například ftalan, fenoly, vícesytné alkoholy, kyseliny;
Vysokomolekulární sloučeniny, jako jsou například pryskyřice.
Ve vysokoúčinné kapalinové chromatografii (HPLC) se používají hlavně dva typy detektorů: fluorimetrický detektor nebo spektrofotometrický detektor s fotodiodovou tyčí. Mez detekce PAH ve fluorimetrické detekci je velmi nízká, což činí tuto metodu vhodnou zejména pro stanovení stopových množství polyaromatických sloučenin. Klasické fluorimetrické detektory však neposkytují prakticky žádné informace o struktuře zkoumané sloučeniny. Moderní konstrukce umožňují zaznamenat fluorescenční spektra, která jsou charakteristická pro jednotlivé sloučeniny, ale v praxi rutinního měření se zatím nerozšířily. Spektrofotometrický detektor s fotodiodovou čárou (PDL) umožňuje zaznamenávat absorpční spektra v UV i viditelném spektrálním rozsahu, tato spektra lze využít k identifikaci. Podobné informace lze získat pomocí detektorů rychlého skenování.
Při výběru analytické techniky pro separaci, identifikaci a kvantifikaci těchto PAH je třeba vzít v úvahu následující podmínky:
Úroveň stanovených obsahů ve studovaných vzorcích;
Počet příbuzných látek;
Použitý analytický postup (postup měření);
Možnosti sériového vybavení.
Vývoj metody pro stanovení prvků alkalických zemin a hořčíku pomocí iontové vysoce výkonné kapalinové chromatografie
Vývoj a zdokonalování metod, které umožňují řešit problémy analýzy vody, je důležitým problémem analytické chemie. Vývoj vysokoúčinné kapalinové chromatografie vysoký tlak podnítil vývoj nového směru v iontoměničové chromatografii, tzv. iontové chromatografie. Syntéza sorbentů pro iontovou chromatografii je obtížná, protože jsou na ně kladeny poměrně velké požadavky. Vzhledem k nedostatku komerčně dostupných vysoce výkonných katexů byla použita dynamicky modifikovaná reverzní fáze, pro kterou byl syntetizován modifikátor: kyselina N-hexadecyl-N-dekanoyl-para-amino-benoylsulfonová ethyl-diisopropylamonium (DGDASC), kde hydrofobní amin obsahující skupinu SO3-, schopný výměny kationtů. Po průchodu roztokem modifikátoru dosáhla absorpce při l = 260 nm 6,4 jednotek optické hustoty (°E) a dosáhla plató. Vypočtená iontoměničová kapacita je 15,65 µmol. Protože kationty prvků alkalických zemin a hořčíku neabsorbují v UV oblasti spektra, byla použita nepřímá UV detekce za použití syntetizovaného UV absorbujícího eluentu 1,4-dipyridinium butan bromidu (DPB bromid). Protože halogenové ionty ničí ocelové části kolony, byl bromidový ion 1,4-dipyridinium butanu nahrazen acetátovým iontem. Když se kolona promyje eluentem, protiion modifikátoru, ethyldiisopropylamonium, je nahrazen iontem absorbujícím UV záření 1,4-dipyridiniumbutanem. Separace kationtů byla provedena při optimální vlnové délce l = 260 nm na stupnici 0,4 A v režimu „scale folding“; polarita rekordéru byla obrácená. Oddělení všech studovaných kationtů bylo dosaženo zavedením komplexotvorného aditiva - kyseliny šťavelové. Detekční limity Mg 2+, Ca 2+, Sr 2+, Ba 2+ jsou 8 μg/l; 16 ug/l; 34 ug/l; 72 µg/l. Za zvolených podmínek byla analyzována vodovodní voda s obsahem Ca 2+ 10,6 + 1,9 mg-ion/l, Mg 2+ -2,5 + mg-ion/l. Chyba reprodukovatelnosti nepřesahuje -2,2 % pro Ca 2+ a 1,4 % pro Mg 2+.
Analýza komplexů kadmia v životním prostředí
Pro studium mechanismů migrace těžkých kovů v biosféře jsou zapotřebí údaje o chemických formách existence kovů v přírodě. Obtíže při analýze sloučenin jedné z nej toxické kovy- kadmium - díky tomu, že tvoří nestabilní komplexy, a když se je snažíte izolovat, dochází k narušení přirozené rovnováhy. V této práci byly studovány sloučeniny kadmia v půdě a rostlinách pomocí techniky založené na chromatografické separaci extraktů s následnou identifikací složek chemickou analýzou. Tento přístup umožnil nejen identifikovat chemické formy kadmia, ale také sledovat jejich přeměny v objektech životního prostředí.
OH-skupiny sacharidů a polyfenolů (včetně flavonoidů), C=O, fosfáty, NH 2, NO 2, SH-skupiny jsou koordinovány s kadmiem v biosférických objektech. Pro účely této studie byla sestavena sada modelových ligandů reprezentujících tyto třídy sloučenin. Interakce modelových ligandů s ve vodě rozpustnými kadmiovými solemi byla studována pomocí UV spektroskopie a HPLC.
K izolaci sloučenin kadmia byla použita extrakce speciálně vybranými (nevytvářejícími komplexy s Cd) rozpouštědly. Tímto způsobem lze kadmium oddělit od všech těžkých kovů, kromě jeho blízkého chemického analoga, zinku. Píky obsahující kadmium a zinek v chromatogramech získaných extraktů byly detekovány vazbou kovů ve formě jejich dithizonátů. K separaci od zinku byl použit rozdíl ve stabilitě komplexů Cd a Zn při pH 6–8. Izolované Cd sloučeniny byly identifikovány pomocí HPLC se změnami pH během eluce. Byla provedena analýza sloučenin kadmia s půdními složkami a rostlinnými pletivy a byly identifikovány látky produkované rostlinami v reakci na zvýšený příjem kadmia z půdy. Bylo prokázáno, že flavonoidy, zejména tricin, jsou ochrannými činidly v obilovinách, alkoxyderiváty cysteinu v luštěninách a jak polyfenoly, tak thioly v brukvovitých rostlinách.
KAPITOLA 4. VYBAVENÍ HPLC
SÉRIE ACCELA
Nový kapalinový chromatograf ACCELA Ultra High Performance Liquid Chromatograf je schopen pracovat v nejširším rozsahu průtoků a tlaků a poskytuje jak typické HPLC separace na konvenčních kolonách, tak ultra rychlé a efektivní separace na kolonách s velikostí částic sorbentu menší než 2 µm při ultravysoké tlaky (větší než 1000 atm.).
Systém obsahuje inertní čerpadlo s kvartérním gradientem schopné dodávat tlaky přesahující 1000 atm a se zpožděním objemu pouze 65 µl, což zajišťuje vysokorychlostní chromatografické separace. Autosampler ACCELA schopný pracovat v cyklu vstřikování vzorku 30 sekund a poskytuje nejvyšší reprodukovatelnost vstřikování. Detektor diodového pole PDA Accela s minimalizovaným objemem průtokové kyvety (2 µl) je optimalizován pro vysokorychlostní chromatografii, využívá patentovanou technologii LightPipe a zachovává si symetrický tvar píku, který přichází s bezchybným chromatografickým systémem a kolonami.
Systém se dokonale spáruje s hmotnostními spektrometry a vytváří nejvýkonnější a nejlepší LC/MS systémy dostupné na světě.
1,9 µm UHP kolony dostupné od Thermo Electron pro všechny aplikace
SÉRIE TSP
Modulární princip konstrukce HPLC přístrojů umožňuje zákazníkovi flexibilně doplňovat zařízení pro řešení jakýchkoliv analytických problémů a při jejich změně je rychle a ekonomicky upravovat. Široká škála modulů zahrnuje čerpadla od izokratických po kvartérní gradient, od mikrokolon po semipreparativní, všechny dostupné detektory, systémy vstřikování vzorků od ručních vstřikovačů po autosamplery s možností manipulace s jakýmkoliv vzorkem, výkonný software pro zpracování výsledků měření a správu všech modulů systému. Všechny moduly jsou certifikovány CSA, TUF/GS, FCC(EMI), VDE (EMI), ISO-9000, jsou kompaktní, mají moderní design, snadno se obsluhují, jsou vybaveny vestavěným displejem a autodiagnostikou systém, umožňují vytvářet a ukládat metody úloh do parametrů paměti. Splňují kritéria "Exemplary Laboratory Practice" (SLP) a jsou uvedeny v Registru měřicích přístrojů Ruské federace. Protokoly měření jsou vydávány v souladu s lékopisy Anglie, USA, Německa a Francie.
Modulární systémy TSP se vyznačují nejvyšší spolehlivostí a stabilitou v provozu.
Kombinace modulů poskytuje analytikovi všechny výhody integrovaného systému na jedné straně a flexibilitu modulárního systému na straně druhé. Bez ohledu na oblast použití vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) - farmakologie, biotechnologie, environmentální analýza, klinická analýza, analýza potravin a nápojů, petrochemická a chemická analýza - tento přístroj je vždy optimálně nakonfigurován tak, aby vyhovoval nejvyšším požadavkům .
Jak výzkumné, tak vysoce výkonné rutinní systémy poskytují:
Vysoce účinné odplyňování rozpouštědlem
Schopnost pracovat s malým a ultra malým množstvím vzorků
Nejvyšší citlivost, jak s UV/VIS detektorem, tak s diodovým polem (se slavnou technologií LightPipe s možností volby délky optické dráhy 1 nebo 5 cm)
Práce s různými sloupci
Nejvyšší kvantitativní přesnost
Možnost automatické práce s různými objemy vzorků
Chyba doby uchování RMS menší než 0,3 %
Minimální pracovní oblast obsazený systémem
Nejvyšší spolehlivost a stabilita parametrů.
Surveyor LC Pump- HPLC pumpa s nejlepší reprodukovatelností retenčního času ze všech 4složkových gradientních pump dostupných na světě. Integrovaný čtyřkanálový vakuový odplyňovač a tlumič pulzací poskytují vynikající základní stabilitu pro maximální citlivost a přesnost kvantifikace.
Autosampler poskytuje nejvyšší výkon a flexibilitu analýzy. Široká řada podnosů na vzorky, od standardních lahviček až po 96- a 384jamkové mikrodestičky, pokrývá potřeby prakticky všech aplikací. Nová technologie neposkytuje téměř žádnou ztrátu nástřiku vzorku, z celkového objemu vzorku 5 µl je autosamplerem vstříknuto téměř 5 µl vzorku.
ZEMĚMĚŘIČ
UV/vizuální detektor a PDA (Diode Array Detector)
Surveyor UV/Vis- detektor ultrafialového a viditelného světla s proměnnou vlnovou délkou je kombinací hospodárnosti a spolehlivosti s nejvyšší citlivostí technologie LightPipe. Díky širokému výběru průtokových kyvet je tento detektor všestranný pro všechny aplikace od těch, které používají kapilární nebo mikrokolonovou chromatografii, až po semipreparativní a preparativní.
Surveyor PDA Detektor je nejcitlivější ze všech HPLC diodových detektorů. Dvoulampová optika zdroje plynule pokrývá celý rozsah vlnových délek od 190 do 800 nm. Vláknový optický paprsek poskytuje vynikající optické rozlišení bez obětování citlivosti.
Zeměměřič RI refraktometrický detektor s minimálním objemem termostatovaná kyveta s plně elektronickým ovládáním z počítače.
Zeměměřič FL fluorometrický skenovací detektor s nejvyšší citlivostí a detekční schopností pro fluorescenci, chemiluminiscenci a fosforescenci.
Široká řada autosamplerů umožňuje pracovat jak s konvenčními lahvičkami, tak s 96-pozičními destičkami, široce používanými v biochemii a klinické praxi. Manipulace je usnadněna použitím podobných destiček pro přípravu vzorků SPE.
400 Elektrický pohon, smyčka Valco (20 µl - standard) s možností částečného plnění.
Kolotoč 96 vzorků.
Elektrický pohon, termostat kolony, smyčka Valco (100 µl - standard) s možností částečného plnění Režim AutoMix pro přípravu vzorků. Kolotoč na vzorky: 84 x 2 ml (vzorky) + 3 x 10 ml (reagencie). Vestavěný sloupcový termostat. 420
Smyčkový autosampler pro výzkumná práce se schopností pracovat v režimech plného, částečného plnění a zavádění mikrolitrových vzorků. Široká nabídka kolotočů (standard - 96 vzorků).
Tabletový autosampler pro destičky s 96 a 384 pozicemi. Nástřik vzorku do tlakové smyčky, možnost zavedení vzorků o objemu menším než 1 µl. Možnost instalace podavače tablet. HPLC
Hlavní výrobci zařízení pro HPLC
· Waters - vysokoúčinná chromatografie, hmotnostní spektrometrie, kolony, extrakce pevnou fází;
Společnost Varian, Inc. - chromatografy a kolony, příslušenství pro extrakci pevnou fází;
· Agilent Technologies - chromatografy a kolony;
· Hypersil - kolony a sorbenty.
· Merck KGaA - TLC desky a příslušenství pro TLC, kolony, sorbenty, mobilní fáze pro HPLC, příslušenství pro extrakci pevnou fází
· Dionex - zařízení a kolony pro HPLC, zejména pro iontovou chromatografii.
Literatura
1. Pilipenko A.T., Pjatnickyj I.V. Analytická chemie. Ve dvou knihách: kn..1 - M .: Chemie, 1990, -480.
1. Pilipenko A.T., Pjatnickyj I.V. Analytická chemie. Ve dvou knihách: kn..2 - M .: Chemie, 1990, -480.
2. Vasiliev V.P. Analytická chemie. Ve 14 hodin Část 2. Fyzikální a chemické metody analýzy: Proc. pro Khimko - technol. specialista. vysoké školy. - M .: Vyšší. škola, 1989. - 384s.
3. Hydrochemické materiály. Svazek 100. Metody a technické prostředky provozního sledování jakosti povrchových vod. L.: Gidrometeo-izdat, 1991. - 200s.
4. Lurie Yu.Yu. Analytická chemie průmyslových odpadních vod / Yu.Yu. Lurie; M.: Chemie Yu, 1984. - 448s.
5. Ewing G. Instrumentální metody chemické analýzy / Per. z angličtiny. M.: Mir, 1989. - 348 s.
6. Gorelik D.O., Konopelko L.A., Pankov E.D. Monitorování prostředí. Ve 2 dílech Petrohrad: Vánoce. 2000. - 260 s.
7. Aivazov B.V. Úvod do chromatografie. M.: Vyšší. škola, 1983. - 450 s.
8. Goldberg K.A., Vigdergauz M.S. Úvod do plynové chromatografie. M.: Chemie, 1990. - 329 s.
9. Stolyarov B.V. a další // Praktická plynová a kapalinová chromatografie. Petrohrad: St. Petersburg State University, 1998. - S. 81.
11. Gorshkov A.G., Marinait I.I. HPLC - metoda monitorování PAH v objektech životního prostředí
12. Torosyan G. O., Martirosyan V. A., Aleksanyan A. R., Zakaryan M. O. Odstranění anilinu z vodných roztoků pomocí odpadních produktů aluminotermální redukce okují válcované mědi
13. L.A. Turkina, G.N. Koroleva Vývoj metody pro stanovení prvků alkalických zemin a hořčíku pomocí iontové vysokoúčinné kapalinové chromatografie
14. Dultseva G.G., Dubtsova Yu.Yu., Skubnevskaya G.I. Analýza komplexů kadmia v životním prostředí
aplikace
STANOVENÍ CLOMAZONE VE VODĚ CHROMATOGRAFICKÝMI METODAMI
METODICKÉ POKYNY MUK 4.1.1415-03
1. Zpracovalo: Federální vědecké centrum pro hygienu. F.F.
Erisman; Moskevská zemědělská akademie. K.A.
Timiryazev; za účasti odboru státního hygienického a epidemiologického dozoru Ministerstva zdravotnictví Ruska. Vývojáři metodiky jsou uvedeni na konci.
3. Schváleno hlavním státním zdravotním lékařem
Ruské federace, první náměstek ministra zdravotnictví Ruské federace, akad. RAMS G.G. Oniščenko 24. června 2003
5. Představeno poprvé.
1. Úvod
Výrobce: FMS (USA).
Obchodní název: COMMAND.
Účinná látka: klomazon.
2-(2-chlorbenzyl)-4,4-dimethyl-3-isoxalidin-3-on (IUPAC)
Světle hnědá viskózní kapalina.
Teplota tání: 25 °C.
Bod varu: 275 -C.
Tlak par při 25 °C: 19,2 MPa.
Rozdělovací koeficient n-oktanol/voda: K logP = 2,5.
Vysoce rozpustný v acetonu, hexanu, ethanolu, methanolu,
chloroform, dichlormethan a acetonitril; Rozpustnost ve vodě -
1,10 g/m3. dm Stabilní při pokojové teplotě minimálně 2 roky, při 50 -C – minimálně 3 měsíce.
Stručný toxikologický profil: Akutní orální
toxicita (LD) pro krysy - 1369 - 2077 mg/kg; akutní dermální
toxicita (LD) pro potkany - více než 2000 mg/kg; akutní
inhalační toxicita (LC) pro krysy - 4,8 mg / cu. dm (4 hodiny).
Hygienické normy. MPC ve vodě - 0,02 mg / cu. dm
Rozsah léku. Clomazone je selektivní herbicid používaný k hubení obilovin a dvouděložných plevelů v porostech sóji a rýže během preemergentní nebo předseťové aplikace.
2. Metoda stanovení clomazonu ve vodě
chromatografické metody
2.1. Základní ustanovení
2.1.1. Princip techniky
Technika je založena na extrakci klomazonu z analyzovaného vzorku hexanem, zahuštění extraktu a následném kvantitativním stanovení alternativními metodami:
vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) s
ultrafialový detektor, plynová kapalinová chromatografie (GLC) s detektorem konstantní rychlosti rekombinace nebo chromatografie na tenké vrstvě (TLC). Kvantitativní stanovení se provádí metodou absolutní kalibrace.
2.1.2. Selektivita metody
Metoda je za navržených podmínek specifická v přítomnosti globálních polutantů životního prostředí: chlorovaných derivátů cykloparafinů (HCH izomery), difenylových sloučenin (DDT a jeho deriváty), jejich metabolitů - polychlorovaných benzenů a fenolů, jakož i v přítomnosti trichloracetát sodný, který lze použít na plodiny jako herbicid.
2.1.3. Metrologická charakteristika metody (P = 0,95)
Činidla, roztoky a materiály
Clomazone s obsahem d. 99,8 %
(FMS, USA)
Dusík, nebo GOST 9293-79
Vodní čpavek, 25%, h GOST 1277-81
Aceton, h GOST 2603-79
n-Hexan, h GOST 2603-79
Peroxid vodíku, 30% vodný roztok GOST 10929-77
Isopropylalkohol, chemicky čistý TU 6-09-402-75
Kyselina sírová, chemicky čistá GOST 4203-77
Kyselina chlorovodíková (chlorovodíková), chemicky čistá GOST 3118-77
Metylalkohol, chemicky čistý GOST
Hydroxid sodný, chemicky čistý, 25% vodný roztok GOST 4323-77
Síran sodný bezvodý, chemicky čistý GOST 1277-81
Dusičnan stříbrný, chemicky čistý GOST 1277-81
2-Fenoxymethanol, h TU 6-09-3688-76
Chromaton N-AW-DMCS (0,16 – 0,20 mm)
s 5% SE-30, Hemapol, Česká republika
Chromaton N-AW-DMCS (0,16 - 0,20 mm) s 1,5
OV-17 + 1,95 % QF-1, Hemapol, Česká republika
Desky pro HPTLC (SSSR)
Records "Kieselgel 60 F-254" (Německo)
Records "Silufol" Česká republika
Papírové filtry "bílá páska", bez popela a předem promyté hexanem TU 6-09-2678-77
2.3. Příbory, vybavení, náčiní
Kapalinový chromatograf Milichrome
s UV detektorem
Chromatografický ocelový sloupec,
délka 64 mm, vnitřní průměr 2 mm,
plněno Silasorbem 600, zrnitost 5 µm
Plynové chromatografy řady "Color" popř
podobné, vybavené konstantním detektorem
rekombinační rychlost (RPR) s limitem
detekce lindanem 4 x 10 g/m3. cm
Chromatografický skleněný sloupec, délka
1 nebo 2 m, vnitřní průměr 2 - 3 mm
Mikrostříkačka typ MSH-10, objem 10 µl TU 5E2-833-024
Zařízení pro třepání typ AVU-6s TU 64-1-2851-78
Vodní lázeň TU 64-1-2850-76
Analytické váhy typu VLA-200 GOST 34104-80E
Chromatografická komora GOST 10565-74
Vodní tryskové čerpadlo GOST 10696-75
Rtuťový křemenný zářič typ OKN-11 TU 64-1-1618-77
Skleněné stříkací pistole GOST 10391-74
Rotační vakuová odparka IR-1M
nebo podobné TU 25-11-917-76
Kompresorová jednotka TU 64-1-2985-78
Sušící skříň TU 64-1-1411-76E
Dělicí nálevky GOST 3613-75
Odměrné baňky, o objemu 100 ml GOST 1770-74
Odměrné válce, o objemu 10, 50 ml GOST 1770-74E
Baňky hruškovitého tvaru s tenkým průřezem,
s kapacitou 100 ml GOST 10394-72
Baňky kónické, o objemu 100 ml GOST 22524-77
Centrifugační zkumavky, měřeno GOST 25336-82E
Pipety, s kapacitou 0,1, 1, 2, 5 a 10 ml GOST 20292-74
Chemické nálevky, kuželové, průměr
34 - 40 mm GOST 25336-82E
2.4. Výběr vzorku
Odběr, skladování a příprava vzorků se provádí v souladu s
"Jednotná pravidla pro odběr vzorků zemědělských produktů, potravinářských produktů a předmětů životního prostředí pro stanovení stopových množství pesticidů", schváleno pro N 2051-79 ze dne 21.08.79
Odebrané vzorky lze uchovávat v chladničce až 5 dní. Před analýzou se voda (v přítomnosti suspenze) filtruje přes volný papírový filtr.
2.5. Příprava na definici
2.5.1. HPLC metoda
2.5.1.1. Příprava mobilní fáze pro HPLC
Do odměrné baňky o objemu 100 ml se pipetou vloží 5 ml isopopanolu a 5 ml methanolu, doplní se po značku hexanem, promíchá se, zfiltruje.
2.5.1.2. Kondicionování sloupců
HPLC kolona se proplachuje směsí hexan-methanol-isopropanol (90:5:5, obj./obj.) po dobu 30 minut. při rychlosti dávkování rozpouštědla 100 ul/min.
2.5.2. Metoda GLC. Příprava a úprava kolony
Hotová náplň (5% SE-30 na Chromaton N-AW-DMCS) se nalije do skleněné kolony, zhutní se ve vakuu, kolona se instaluje do termostatu chromatografu, není připojena k detektoru a stabilizuje se v proudu dusíku při teplotě 250 -C po dobu 10 - 12 hodin
2.5.3. Metoda TLC
2.5.3.1. Příprava vyvíjecích činidel
2.5.3.1.1. Vyvíjecí činidlo č. 1
1 g dusičnanu stříbrného se rozpustí v 1 ml destilované vody, přidá se 10 ml 2-fenoxymethanolu, 190 ml acetonu, 1-2 kapky peroxidu vodíku, roztok se promíchá a přelije do tmavé skleněné lahvičky.
2.5.3.2.2. Vyvíjecí činidlo N2
V odměrné baňce na 100 ml se rozpustí 0,5 g dusičnanu stříbrného v 5 ml destilované vody, přidá se 10 ml 25% vodného amoniaku, roztok se upraví na 100 ml acetonem, promíchá se a přenese do tmavé skleněné láhve.
2.5.3.2. Příprava mobilní fáze pro TLC
Do odměrné baňky o objemu 100 ml přidejte 20 ml acetonu a přidejte hexan po rysku, promíchejte. Směs se nalije do chromatografické komory s vrstvou ne větší než 6 - 8 mm za 30 minut. Před zahájením chromatografie.
2.5.4. Příprava standardních roztoků
Zásobní standardní roztok klomazonu o koncentraci 100 ug/ml se připraví rozpuštěním 0,010 g přípravku obsahujícího 99,8 % AI v hexanu ve 100 ml odměrné baňce. Roztok se uchovává v chladničce po dobu jednoho měsíce.
Pracovní standardní roztoky o koncentraci 0,4; 1,0; 2,0; 4,0; 10,0; 20 a 40,0 ug/ml se připraví ze zásobního standardního roztoku klomazonu vhodnými sériovými ředěními hexanem.
Pracovní roztoky se uchovávají v chladničce ne déle než měsíc.
2.5.5. Konstrukce kalibračního grafu
2.5.5.1. Kalibrační křivka A (měření podle odstavce 2.7.1, HPLC)
Pro sestavení kalibračního grafu se do injektoru chromatografu vstříkne 5 µl pracovního standardního roztoku klomazonu o koncentraci 4,0; 10,0; 20,0 a 40 ug/ml.
2.5.5.2. Kalibrační křivka B (měření podle odstavce 2.7.2, GLC)
Pro sestavení kalibračního grafu se do výparníku chromatografu nastříkne 5 µl pracovního standardního roztoku klomazonu o koncentraci 0,4; 1,0; 2,0; 4.0 a 10.0.
Proveďte alespoň 5 paralelních měření. Najděte průměrnou výšku chromatografického píku pro každou koncentraci. Sestrojte kalibrační graf (A nebo B) závislosti výšky chromatografického píku v mm na koncentraci klomazonu v roztoku v µg/ml.
2.6. Popis definice
100 ml analyzovaného vzorku vody se umístí do dělicí nálevky o objemu 250 ml, přidá se 10 ml 25% vodného roztoku hydroxidu sodného, promíchá se a přidá se 20 ml n-hexanu. Nálevka se protřepává 3 minuty, po oddělení fází se hexanová vrstva nalije do hruškovité baňky o objemu 100 ml a nechá se projít vrstvou bezvodého síranu sodného umístěnou v kuželové nálevce na skládaném filtračním papíru. Extrakce léčiva z vodného vzorku se opakuje ještě dvakrát za použití 20 ml n-hexanu. Spojený hexanový extrakt se odpaří na rotační vakuové odparce při teplotě 40 -C téměř do sucha, zbytek se odfoukne proudem vzduchu nebo dusíku zvláštní čistoty. Suchý zbytek se rozpustí v 0,1 ml (HPLC, TLC) nebo 0,25 ml (GLC) n-hexanu a analyzuje se jednou z chromatografických metod.
2.7. Chromatografické podmínky
Kapalinový chromatograf s ultrafialovým detektorem Milichrom (Rusko).
Ocelový sloup 64 mm dlouhý, vnitřní průměr 2 mm,
plněno Silasorbem 600, zrnitost 5 mikronů.
Teplota kolony: pokojová.
Mobilní fáze: hexan-isopropanol-methanol (90:5:5, obj./obj.).
Průtok elučního činidla: 100 ul/min.
Provozní vlnová délka: 240 nm.
Citlivost: 0,4 jednotky absorpce na stupnici.
Objem nástřiku: 5 µl.
Čas výstupu Clomazone: asi 6 min.
Lineární rozsah detekce: 20 - 200 ng.
Vzorky produkující píky větší než 40 ug/ml standardního roztoku se zředí HPLC mobilní fází.
Plynový chromatograf "Tsvet-570" s detektorem konstantní rychlosti rekombinace iontů.
Skleněná kolona 1 m dlouhá, vnitřní průměr 3 mm, naplněná Chromatonem N-AW-DMCS s 5 % SE-30 (0,16 - 0,20 mm).
Pracovní stupnice elektroměru je 64 x 10 10 Ohm.
Rychlost magnetofonu 200 mm/h.
Teplota sloupcového termostatu - 190 -С
detektor - 300 -C
výparník - 220 -C
Rychlost nosného plynu (dusík) - 60 ml / min.
Objem vstříknutého vzorku je 5 µl.
Doba výstupu clomazonu je 2,5 minuty.
Lineární rozsah detekce: 2 - 50 ng.
Vzorky, které produkují píky větší než 10 ug/ml standardního roztoku, se zředí hexanem.
Aby se zlepšila přesnost identifikace klomazonu v přítomnosti gama-HCCH s blízkým retenčním časem ve vzorku, je klomazon ze vzorku odstraněn působením koncentrované kyseliny sírové. Opakovaná analýza vzorku umožňuje stanovit příspěvek klomazonu k primárnímu chromatografickému signálu.
Roztok hexanu v baňce získaný podle odstavce 2.6 kvantitativně
(nebo jeho alikvot) se aplikuje na chromatografické desky "Silufol", "Kieselgel 60F-254" nebo "Plates for HPTLC". V blízkosti se aplikují standardní roztoky v objemu odpovídajícím obsahu klomazonu 1, 2, 5 a 10 μg. Destička se umístí do chromatografické komory obsahující směs n-hexan-aceton (4:1, obj./obj.). Po vyvolání chromatogramu se deska vyjme z komory, umístí se pod průvan, dokud se rozpouštědla neodpaří, pak se zpracuje jedním z vyvíjecích činidel a umístí se na 5 minut pod ultrafialovou lampu. Lokalizační zóna léčiva na destičkách "Silufol", "Plates for HPTLC" a "Kieselgel 60F-254" se jeví jako šedohnědé skvrny s hodnotami Rf 0,35, 0,85 a 0,43. Pro stanovení clomazonu pomocí TLC můžete použít destičky "Alugram" a "Polygram" (vyrobeno Německem). Hodnota Rf klomazonu na těchto plotnách je 0,37 a 0,38.
3. Bezpečnostní požadavky
Při práci s organickými rozpouštědly, toxickými látkami, elektrickými ohřívači je nutné dodržovat obecně uznávaná bezpečnostní pravidla.
4. Kontrola chyby měření
Provozní kontrola chyby a reprodukovatelnosti měření se provádí v souladu s doporučeními MI 2335-95. GSI "Interní kontrola kvality výsledků kvantitativní chemické analýzy".
5. Vývojáři
Yudina T.V., Fedorova N.E. (FNTSG pojmenované po F.F. Erismanovi).
Davidyuk E.I. (UkrNIIGINTOX, Kyjev); Kisenko M.A., Demčenko V.F. (Ústav pracovního lékařství Akademie věd a Akademie lékařských věd Ukrajiny, Kyjev).
Kapalinová adsorpční chromatografie na koloně
K separaci směsi látek v adsorpční koloně dochází v důsledku jejich rozdílné vstřebatelnosti na daném adsorbentu (v souladu se zákonem adsorpční substituce stanoveným M. S. Tsvetem).
Adsorbenty jsou porézní tělesa s vysoce vyvinutým vnitřním povrchem, která zadržují kapaliny prostřednictvím mezimolekulárních a povrchových jevů. Mohou to být polární a nepolární anorganické a organické sloučeniny. Mezi polární adsorbenty patří silikagel (sušený želatinový oxid křemičitý), oxid hlinitý, uhličitan vápenatý, celulóza, škrob atd. Nepolární sorbenty – aktivní uhlí, kaučukový prášek a mnohé další získané synteticky.
Na adsorbenty se vztahují následující požadavky: S nesmí vstupovat do chemických reakcí s mobilní fází a látkami, které mají být separovány; S musí mít mechanickou pevnost; S zrna adsorbentu musí mít stejný stupeň disperze.
Při volbě podmínek pro chromatografický proces se berou v úvahu vlastnosti adsorbentu a adsorbovaných látek.
V klasické verzi kapalinové sloupcové chromatografie (LCC) prochází eluent (PF) chromatografickou kolonou, což je skleněná trubice o průměru 0,5–5 cm a délce 20–100 cm, naplněná sorbentem (NF). Eluent se pohybuje vlivem gravitace. Rychlost jeho pohybu lze nastavit pomocí jeřábu ve spodní části sloupu. Směs, která má být analyzována, se umístí na horní část kolony. Jak se vzorek pohybuje kolonou, složky se oddělují. V určitých intervalech se odebírají frakce eluentu uvolněné z kolony, které se analyzují jakoukoli metodou, která umožňuje měření koncentrací analytů.
Sloupcová adsorpční chromatografie se v současnosti používá především ne jako samostatná metoda rozboru, ale jako metoda předběžné (někdy finální) separace složitých směsí na jednodušší, tzn. připravit pro analýzu jinými metodami (včetně chromatografických). Například směs tokoferolů se oddělí na koloně s oxidem hlinitým, nechá se projít eluentem a frakce a-tokoferolu se shromáždí pro následné fotometrické stanovení.
Chromatografická separace směsi na koloně v důsledku pomalého postupu PF trvá dlouho. Pro urychlení procesu se chromatografie provádí pod tlakem. Tato metoda se nazývá vysoce výkonná kapalinová chromatografie (HPLC).
Modernizace zařízení používaného v klasické kapalinové kolonové chromatografii z ní udělala jednu z nejslibnějších a moderní metody analýza. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie je vhodná metoda pro separaci, preparativní izolaci a provádění kvalitativní a kvantitativní analýzy netěkavých, termolabilních sloučenin s nízkou i vysokou molekulovou hmotností.
Tato metoda využívá v závislosti na typu použitého sorbentu 2 možnosti chromatografie: na polárním sorbentu s použitím nepolárního eluentu (možnost přímé fáze) a na nepolárním sorbentu s použitím polárního eluentu - tzv. reverzní fáze high -výkonná kapalinová chromatografie (RP HPLC).
Při přechodu eluentu do eluentu se rovnováha za podmínek RPHLC ustaví mnohonásobně rychleji než za podmínek polárních sorbentů a nevodných PF. V důsledku toho, stejně jako pohodlí práce s vodou a voda-alkohol eluenty, RPHLC nyní získal velkou popularitu. Většina analýz HPLC se provádí pomocí této metody.
Instrumentace pro HPLC
Soubor moderního zařízení pro HPLC sestává zpravidla ze dvou čerpadel 3,4 (obr. 7.1.1.1), řízených mikroprocesorem 5 a dodávajících eluent podle specifického programu. Čerpadla vytvářejí tlak až 40 MPa. Vzorek je vstřikován přes speciální zařízení (injektor) 7 přímo do proudu eluentu. Po průchodu chromatografickou kolonou 8 jsou látky detekovány vysoce citlivým průtokovým detektorem 9, jehož signál je zaznamenáván a zpracováván mikropočítačem 11. V případě potřeby jsou frakce automaticky vybírány v okamžiku špičkového výstupu.
Kolony pro HPLC jsou vyrobeny z nerezové oceli o vnitřním průměru 2 - 6 mm a délce 10 - 25 cm. Kolony jsou plněny sorbentem (NF). Jako NF se používá silikagel, oxid hlinitý nebo modifikované sorbenty. Silikagel je obvykle modifikován chemickým zavedením různých funkčních skupin do jeho povrchu.
Detektory. Registrace výstupu z kolony samostatné složky se provádí pomocí detektoru. Pro registraci můžete využít změnu libovolného analytického signálu pocházejícího z mobilní fáze a souvisejícího s povahou a množstvím složky směsi. Kapalinová chromatografie využívá takové analytické signály, jako je absorpce světla nebo emise světla vystupujícího roztoku (fotometrické a fluorimetrické detektory), index lomu (refraktometrické detektory), potenciál a elektrická vodivost (elektrochemické detektory) atd.
Průběžně detekovaný signál zaznamenává rekordér. Chromatogram je sekvence signálů detektoru zaznamenaných na magnetofon, které jsou generovány, když jednotlivé složky směsi opustí kolonu. V případě separace směsi jsou na vnějším chromatogramu viditelné samostatné píky. Poloha píku na chromatogramu se používá pro účely identifikace látky, výška nebo plocha píku se používá pro účely kvantitativního stanovení.
Kvalitativní analýza
Nejdůležitější charakteristiky chromatogramu - retenční čas tR a s ním spojený retenční objem - odrážejí povahu látek, jejich schopnost sorpce na materiálu stacionární fáze, a proto jsou za konstantních chromatografických podmínek prostředky k identifikaci látky. Pro danou kolonu s určitým průtokem a teplotou je retenční čas každé sloučeniny konstantní (obrázek 7.1.1.2), kde t.R(A) je retenční čas složky A analyzované směsi od okamžiku, kdy je vstříknuta do kolona, dokud se na výstupu z kolony neobjeví maximální pík, 1K(ss) - retenční čas vnitřního standardu (látka zpočátku nepřítomná v analyzované směsi), h - výška píku (mm), ab - šířka píku v polovině jeho výšky, mm.
K identifikaci látky pomocí chromatogramu se obvykle používají standardní vzorky nebo čisté látky. Porovnejte retenční čas neznámé složky IR* s retenčním časem IRCT známých látek. Ale spolehlivější identifikace měřením relativního retenčního času
V tomto případě se do kolony nejprve zavede známá látka (vnitřní standard) a změří se její retenční čas tR(Bc), poté se testovaná směs chromatograficky separuje (chromatografuje), ke které se předběžně přidá vnitřní standard. Relativní retenční čas se stanoví vzorcem (7.1.1.1).
Kvantitativní analýza
Tato analýza je založena na závislosti výšky píku h nebo jeho plochy S na množství látky. Pro úzké píky je výhodnější měření h, pro široké rozmazané píky - S. Plocha píku se měří různými způsoby: vynásobením výšky píku (h) jeho šířkou (ai / 2), měřenou v polovině jeho výšky (obr. 7.2.3); plánování; pomocí integrátoru. Moderní chromatografy jsou vybaveny elektrickými nebo elektronickými integrátory.
Ke stanovení obsahu látek ve vzorku se používají především tři metody: metoda absolutní kalibrace, metoda vnitřní normalizace a metoda vnitřního standardu.
Metoda absolutní kalibrace je založena na předběžném stanovení vztahu mezi množstvím vnesené látky a plochou nebo výškou píku na chromatogramu. Známé množství kalibrační směsi se zavede do chromatogramu a určí se plochy nebo výšky získaných píků. Sestavte graf plochy nebo výšky píku z množství vstříknuté látky. Testovaný vzorek se analyzuje, změří se plocha nebo výška píku složky, která má být stanovena, a na základě kalibrační křivky se vypočte její množství.
Tato metoda poskytuje informaci pouze o relativním obsahu složky ve směsi, ale neumožňuje určit její absolutní hodnotu.
Metoda vnitřního standardu je založena na porovnání vybraného parametru píku analytu se stejným parametrem standardní látky zaváděné do vzorku ve známém množství. Do zkušebního vzorku se zavede známé množství takové standardní látky, jejíž pík je dostatečně dobře oddělen od píků složek zkoušené směsi.
Poslední dvě metody vyžadují zavedení korekčních faktorů charakterizujících citlivost použitých detektorů na analyzované látky. Pro různé typy detektorů a různé látky je koeficient citlivosti stanoven experimentálně.
Kapalinová adsorpční chromatografie také využívá analýzu frakcí roztoků odebraných v okamžiku, kdy látka opouští kolonu. Analýza může být provedena různými fyzikálně-chemickými metodami.
Kapalinová adsorpční chromatografie se používá především k separaci organických látek. Tato metoda je velmi úspěšná při studiu složení ropy, uhlovodíků, efektivně odděluje trans- a cis-izomery, alkaloidy atd. HPLC lze použít ke stanovení barviv, organických kyselin, aminokyselin, cukrů, nečistot pesticidů a herbicidů, léčivých látek a další kontaminanty v potravinářských výrobcích.
(OFS 42-0096-09)
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) je metoda sloupcové chromatografie, ve které je mobilní fáze (MP) kapalná
kost pohybující se přes chromatografickou kolonu naplněnou nepodporovanou
vizuální fáze (sorbent). HPLC kolony se vyznačují vysokým hydraulickým tlakem na vstupu kolony, proto se někdy nazývá HPLC
s názvem „High Pressure Liquid Chromatography“.
V závislosti na mechanismu separace látek se rozlišují:
obecné možnosti HPLC: adsorpce, distribuce, iontová výměna,
exkluzivní, chirální atd.
V adsorpční chromatografii dochází k separaci látek díky jejich rozdílné schopnosti adsorbovat se a desorbovat s rostoucí
povrch adsorbentu s rozvinutým povrchem, například silikagel.
Při rozdělovací HPLC dochází k separaci v důsledku rozdílu v distribučních koeficientech látek, které mají být separovány, mezi imobilními
(obvykle chemicky roubované na povrch pevného nosiče) a
mobilní fáze.
Podle polarity se PF a NF HPLC dělí na normální fázi a ob-
fázová rotace.
Normální fáze se nazývá varianta chromatografie, ve které
použijte polární sorbent (například silikagel nebo silikagel s přídavkem
stočené NH2 - nebo CN-skupiny) a nepolární PF (například hexan s různými
osobní doplňky). Ve variantě chromatografie s reverzní fází
používat nepolární chemicky modifikované sorbenty (např.
nepolární alkylový radikál C18) a polární mobilní fáze (např.
methanol, acetonitril).
Při iontoměničové chromatografii molekuly látek směsi, disociace
v roztoku na kationty a anionty se při průchodu oddělují
sorbentu (katexu nebo aniontoměniče) kvůli jejich rozdílným směnným rychlostem s iontovými
mi skupiny sorbentu.
Při vyloučení (síto, gelová penetrace, gelová filtrace)
Chromatografické molekuly látek jsou odděleny podle velikosti kvůli jejich různé schopnosti pronikat do pórů stacionární fáze. Zároveň první z
z kolon vycházejí největší molekuly (s nejvyšší molekulovou hmotností), které mohou proniknout do minimálního počtu pórů stacionární fáze,
a látky s malou velikostí molekul vycházejí jako poslední.
Oddělení často neprobíhá jedním, ale několika mechanismy současně.
Metodu HPLC lze použít ke kontrole kvality všech negativních
podobné analyty. K analýze se používají vhodné přístroje - kapalinové chromatografy.
Složení kapalinového chromatografu obvykle zahrnuje následující základní
uzly:
– Jednotka na přípravu PF včetně nádoby s mobilní fází (nebo nádoba
sti s jednotlivými rozpouštědly, která jsou součástí mobilní fáze
zy) a PF odplyňovací systém;
– čerpací systém;
– mixér mobilní fáze (je-li to nutné);
– systém vstřikování vzorku (injektor);
– chromatografická kolona (lze instalovat do termostatu);
– detektor;
– systém sběru a zpracování dat.
Čerpací systém
Čerpadla dodávají PF do kolony danou konstantní rychlostí. Složení mobilní fáze může být konstantní nebo variabilní.
během analýzy. V prvním případě se proces nazývá izokratický,
a ve druhém - gradient. Někdy se instaluje před čerpací systém
filtry s průměrem pórů 0,45 µm pro filtraci mobilní fáze. Moderní
Variabilní čerpací systém kapalinového chromatografu se skládá z jednoho nebo více čerpadel řízených počítačem. To vám umožní změnit
stává se PF podle specifického programu s gradientovou elucí. Sme-
míchání složek PF v mísiči může probíhat jak při nízkém tlaku
iontové (před čerpadly) a při vysokém tlaku (za čerpadly). Mixér lze použít pro přípravu PF a izokratickou eluci,
přesnějšího poměru složek se však dosáhne s předběžnou
míchání složek PF pro izokratický proces. Analytická HPLC čerpadla umožňují udržovat konstantní průtok PF do kolony v rozsahu od 0,1 do 10 ml/min při vstupním tlaku kolony do 50 MPa. Je však vhodné, aby tato hodnota nepřekročila
shalo 20 MPa. Tlakové pulsace jsou minimalizovány speciálním tlumením
systémy objímky zahrnuté v konstrukci čerpadel. Pracovní díly na-
čerpadla jsou vyrobena z korozivzdorných materiálů, což umožňuje použití agresivních složek ve složení PF.
Kohoutky
Podle návrhu mohou být mixéry statické nebo dynamické.
mic.
V mixéru se tvoří jedna mobilní fáze
specifická rozpouštědla dodávaná čerpadly, pokud požadovaná směs nebyla předem připravena. Míchání rozpouštědel obvykle probíhá spontánně, ale někdy se používají systémy s nuceným mícháním.
šití.
Vstřikovače
Injektory mohou být univerzální pro zavádění vzorků z
1 µl až 2 ml nebo diskrétní pro nástřik vzorku pouze určitého objemu
ema. Oba typy vstřikovačů mohou být automatické ("autoinjectors" nebo "auto-samplers"). Injektor pro vstup vzorku (roztoku) není umístěn -
těsně před chromatografickou kolonou. Konstrukce injektoru umožňuje změnit směr toku PF a předběžně zavést vzorek do smyčky o určitém objemu (obvykle od 10 do 100 μl).
Tento objem je uveden na štítku smyčky. Konstrukce injektoru umožňuje výměnu smyčky. Zavést analyzované řešení do neprův.
tomatic injector používá ruční mikrostříkačku s objemem výrazně
výrazně převyšující objem smyčky. Přebytek injekčního roztoku, nikoli
ve smyčce se vyhodí a do kolony se vstříkne přesně a vždy stejný objem vzorku. Ruční neúplné naplnění smyčky snižuje přesnost
přesnost a reprodukovatelnost dávkování a následně snižuje přesnost
a reprodukovatelnost chromatografické analýzy.
Chromatografický sloupec
Chromatografické kolony jsou obvykle nerezové, skleněné nebo plastové trubice naplněné sorbentem a uzavřené.
na obou stranách s filtry o průměru pórů 2–5 µm. Délka analytické
kolona, v závislosti na mechanismu chromatografické separace, může být v rozsahu od 5 do 60 cm nebo více (obvykle je to
10-25 cm), vnitřní průměr - od 2 do 10 mm (obvykle 4,6 mm). V mikrokolonách chromu se používají kolony s vnitřním průměrem menším než 2 mm
toografie. Používají se také kapilární kolony s vnitřními průměry.
rum asi 0,3-0,7 mm. Kolony pro preparativní chromatografii mají vnitřní průměr do 50 mm nebo více.
Před analytickou kolonou lze instalovat krátké kabely.
sloupce (předsloupce) plnící různé pomocné funkce
(častěji - ochrana analytické kolony). Typicky se analýza provádí při
při pokojové teplotě, aby se však zvýšila účinnost separace a
zkrácení doby analýzy lze použít termostat
tirovaniye kolon při teplotách ne vyšších než 60 C. Při více než vysoké teploty možná destrukce sorbentu a změna složení PF.
Stacionární fáze (sorbent)
Běžně používané sorbenty jsou:
1. Silikagel, oxid hlinitý, porézní grafit se používají v normální
chromatografie na malé fázi. V tomto případě retenční mechanismus
čaj - obvykle adsorpce;
2. Pryskyřice nebo polymery s kyselými nebo zásaditými skupinami. Rozsah - iontoměničová chromatografie;
3. Porézní silikagel nebo polymery (vylučovací chromatografie);
4. Chemicky upravené sorbenty (sorbenty s roubovaným fa-
zami), připravované nejčastěji na bázi silikagelu. Mechanismem zadržování je ve většině případů distribuce mezi mobilními zařízeními
noe a stacionární fáze;
5. Chemicky modifikované chirální sorbenty, např.
vodné celulózy a amylózy, proteiny a peptidy, cyklodextriny,
používá se k separaci enantiomerů (chirální chromatografie)
Sorbenty vázané fáze mohou mít různé stupně chemického složení
chesky modifikace. Částice sorbentu mohou být sférické nebo nesférické.
pravidelný tvar a různou poréznost.
Nejčastěji používané spojené fáze jsou:
– oktylových skupin(sorbent oktylsilan nebo C8);
– oktadecylové skupiny(sorbent oktadecylsilan
(ODS) nebo C18);
– fenylové skupiny(sorbent fenylsilan);
– kyanopropylové skupiny(sorbent CN);
– aminopropylové skupiny(sorbent NH2);
– diolové skupiny (sorbent diol).
Nejčastěji se analýza provádí na nepolárních vázaných fázích v
reverzní fáze s použitím sorbentu C18.
V některých případech je vhodnější použít normální
fázová chromatografie. V tomto případě se používá silikagel nebo polární vázané fáze („CN“, „NH2“, „diol“) v kombinaci s nepolárními soluty.
Sorbenty vázané fáze jsou chemicky stabilní při hodnotách pH od 2,0 do 8,0, pokud výrobce neuvádí jinak.
Částice sorbentu mohou mít kulový nebo nepravidelný tvar a různou poréznost. Velikost částic sorbentu v analytické HPLC je obvykle 3–10 µm, v preparativní HPLC až 50 µm nebo více.
Používají se také monolitické sorbenty.
Vysoká separační účinnost je zajištěna velkým povrchem částic sorbentu (což je důsledek jejich mikroskopie).
přítomnost pórů), stejně jako stejnoměrnost složení sorbentu a jeho husté a jednotné balení.
Detektory
Používají se různé metody detekce. V obecném případě PF se složkami rozpuštěnými v něm po chromatografické koloně
ki spadá do detektorové cely, kde se nepřetržitě měří jedna nebo druhá jeho vlastnost (absorpce v UV nebo viditelné oblasti spektra, fluorescence,
index lomu, elektrická vodivost atd.). Výsledný chromatogram je grafem závislosti nějaké fyzikální
nebo fyzikálně-chemický parametr PF na čas.
Nejběžnější jsou spektrofotometrické
detektory (včetně diodové matice), registrující změnu optiky
hustota v ultrafialové, viditelné a často v blízké infračervené oblasti
další oblasti spektra od 190 do 800 nebo 900 nm. V tomto případě chromatogram
čaje je závislost optické hustoty PF na čase.
Tradičně používaný spektrofotometrický detektor umožňuje
umožňuje detekci při jakékoli vlnové délce v jejím provozním rozsahu
zóna. Používají se také vícevlnné detektory, které umožňují vedení
provádět detekci na několika vlnových délkách současně.
Pomocí detektoru diodového pole je možné nejen provádět detekci na několika vlnových délkách najednou, ale také téměř okamžitě
je možné (bez skenování) kdykoliv získat optické spektrum PF, což značně zjednodušuje kvalitativní analýzu separovaných složek
komponenty.
Citlivost fluorescenčních detektorů je přibližně 1000krát vyšší než u spektrofotometrických. V tomto případě se použije buď vlastní fluorescence nebo fluorescence odpovídajících derivátů, pokud samotný analyt nefluoreskuje. Moderní
Vyměnitelné fluorescenční detektory umožňují nejen získat chromato-
gramů, ale také k záznamu excitačních a fluorescenčních spekter analýzy
zyable spojení.
Refraktometrické detektory se používají k analýze vzorků, které neabsorbují v UV a viditelné oblasti spektra (například sacharidy).
(refraktometry). Nevýhodou těchto detektorů je jejich nízká (oproti spektrofotometrickým detektorům) citlivost a značná teplotní závislost intenzity signálu (detektor musí být termostatovaný).
Používají se také elektrochemické detektory (konduktometrické
obloha, amperometrie atd.), hmotnostní spektrometrii a Fourierovu IČ
detektory, detektory rozptylu světla, radioaktivity a některé další
Mobilní fáze
V Jako PF lze použít různá rozpouštědla, jednotlivá i jejich směsi.
V normální fáze Chromatografie obvykle používá tekutý uhlík
uhlovodíky (hexan, cyklohexan, heptan) a další relativně nepolární
rozpouštědla s malým přídavkem polárních organických sloučenin,
které regulují eluční sílu PF.
V chromatografii na reverzní fázi zahrnuje složení PF polární nebo-
organická rozpouštědla (obvykle acetonitril a methanol) a voda. Pro opti-
Separační studie často používají vodné roztoky s určitým znaménkem
hodnota pH, zejména roztoky pufrů. Používají se anorganické přísady
vápenaté a organické kyseliny, zásady a soli a další sloučeniny (na-
například chirální modifikátory k oddělení enantiomerů na achirální
nom sorbentu).
Kontrola hodnoty pH musí být provedena odděleně pro vodnou složku, a nikoli pro její směs s organickým rozpouštědlem.
PF se může skládat z jednoho rozpouštědla, v případě potřeby často ze dvou
dimity - od tří nebo více. Složení PF je indikováno jako objemový poměr jeho složek. V některých případech mše
poměr, který musí být zvlášť stanoven.
Při použití UV spektrofotometrického detektoru by PF neměl mít výraznou absorpci při vlnové délce zvolené pro detekci. Limit průhlednosti nebo optické hustoty při určování
často je uváděna specifikovaná vlnová délka rozpouštědla konkrétního výrobce
je na obalu.
Chromatografická analýza je značně ovlivněna stupněm čistoty PF, proto je vhodnější používat vyrobená rozpouštědla
nye speciálně pro kapalinovou chromatografii (včetně vody).
PF a analyzované roztoky by neměly obsahovat nerozpuštěné
částice a bublinky plynu. Voda získaná v laboratoři
vodné roztoky předem smíchané s vodou organická rozpouštědla
Rozpouštědla, stejně jako analyzované roztoky, musí být podrobeny jemné filtraci a odplynění. K tomuto účelu se obvykle používá filtrace.
za vakua přes membránový filtr inertní vůči tomuto rozpouštědlu nebo roztoku s velikostí pórů 0,45 μm.
Systém sběru a zpracování dat
Moderní systém zpracování dat je konjugovaný
osobní počítač připojený k chromatografu s nainstalovaným softwarem
software, který vám umožní zaregistrovat a zpracovat chrono-
matogramu, dále řídit provoz chromatografu a monitorovat hl
mi parametry chromatografického systému.
Seznam chromatografických podmínek, které mají být specifikovány
V soukromé monografii jsou rozměry ko-
kolony, typ sorbentu s uvedením velikosti částic, teplota kolony (je-li nutná regulace teploty), objem vstřikovaného vzorku (objem smyčky),
Stav PF a způsob jeho přípravy, rychlost posuvu PF, podmínky detektoru a detekce, popis režimu gradientu (pokud je použit), doba chromatografie.
Iontová výměna a iontová HPLC
Jako organická látka se pro analýzu používá iontoměničová chromatografie
skikh (heterocyklické báze, aminokyseliny, proteiny atd.) a non-
ganické (různé kationty a anionty) sloučeniny. Separace součástí
složek analyzované směsi v iontoměničové chromatografii je založena na reverzibilní interakci iontů analyzovaných látek s iontovými skupinami.
pami sorbent. Jako sorbenty se používají aniontoměniče nebo katexy.
vy. Tyto sorbenty jsou převážně buď polymerní iontové
výměnné pryskyřice (obvykle kopolymery styrenu a divinylbenzenu s roubem
iontové skupiny) nebo silikagely s naroubovanými iontoměničovými skupinami. K separaci aniontů se používají sorbenty se skupinami -(CH2)3 N+ X–, k separaci kationtů sorbenty se skupinami -(CH2)SO3 – H+.
Typicky se polymerní pryskyřice používají k separaci aniontů a k separaci e-
kationty jsou modifikované silikagely.
Jako PF v iontoměničové chromatografii se používají vodné roztoky kyselin, zásad a solí. Obvykle se používají vyrovnávací závody
roztoky, které umožňují udržovat určité hodnoty pH. Je také možné použít malé přísady organických látek mísitelných s vodou
cal rozpouštědla - acetonitril, methanol, ethanol, tetrahydrofuran.
Iontová chromatografie- varianta iontoměničové chromatografie, v
který se používá ke stanovení koncentrace iontů analytu
pomocí konduktometrického detektoru. Pro vysoce citlivé operace
Pro stanovení změn elektrické vodivosti procházející detektorem PF musí být elektrická vodivost pozadí PF nízká.
Existují dvě hlavní varianty iontové chromatografie.
První z nich je založen na potlačení elektrické vodivosti elektrolytu
že PF pomocí druhé iontoměničové kolony umístěné mezi anal-
lytická kolona a detektor. V této koloně probíhá neutralizace
PF a analyzované sloučeniny vstupují do detektorové cely při deionizaci
zirovannoy voda. Detekované ionty jsou jediné ionty
zajištění vodivosti PF. Nevýhodou supresorové kolony je nutnost její regenerace v poměrně krátkých intervalech.
mě. Potlačovací kolona může být nahrazena nepřetržitě pracujícím
membránový supresor, ve kterém je složení membrány kontinuálně
je tok regeneračního roztoku pohybující se ve směru
proti směru toku PF.
Druhou verzí iontové chromatografie je jednokolonová iontová chromatografie.
matografie. V této variantě je použit PF s velmi nízkou elektrickou vodivostí.
obsah vody. Slabé organické sloučeniny jsou široce používány jako elektrolyty.
nebeské kyseliny - benzoová, salicylová nebo isoftalová.
VELIKOST HPLC
Velikostní vylučovací chromatografie (gelová chromatografie) je speciální verze HPLC založená na separaci molekul podle jejich velikosti. Rozdělení
molekul mezi stacionární a mobilní fází je založena na velikosti mo-
molekul a částečně na jejich tvaru a polaritě. Pro oddělení použijte
porézní sorbenty - polymery, silikagel, porézní skla a polysacharidy.
Velikost částic sorbentů je 5–10 µm.
Výhodou porézních skel a silikagelu je rychlá difúze molekul PF a analytu do pórů, stabilita za různých podmínek (i za vysokých teplot). Polymerní sorben -
jste kopolymery styrenu a divinylbenzenu (jedná se o hydro-
fobické sorbenty používané s nepolárními mobilními fázemi) a
hydrofilní gely získané ze sulfonovaných divinylbenzenových nebo polyakrylamidových pryskyřic.
Jsou možné dva limitující typy interakce molekul s porézní stacionární fází. Molekuly větší než střední průměr póru do sorbentu vůbec nepronikají a jsou eluovány společně s mobilní fází.
zoy první. Molekuly s průměrem mnohem menším, než je velikost pórů daného druhu
ohyby do něj volně pronikají, zůstávají nejdéle ve stacionární fázi a jsou eluovány jako poslední. Molekuly střední velikosti pronikají do pórů sorbentu v závislosti na jejich velikosti a částečně v závislosti na jejich tvaru. Eluují s různými retenčními časy mezi nimi
naše největší a nejmenší molekuly. K oddělení složek chromatografovaného vzorku dochází v důsledku opakovaných ak-
difúzi složek vzorku do pórů sorbentu a naopak.
Při vylučovací chromatografii pro charakterizaci retence,
použije se retenční objem rovný součinu průtoku PF a retenčního času.
Mobilní fáze. Volba PF závisí na typu sorbentu. Vyloučení-
chromatografie se obecně dělí na gelovou filtraci a gelovou chromatografii.
permeační chromatografie.
K separaci se používá metoda gelové filtrační chromatografie
ve vodě rozpustných sloučenin na hydrofilních sorbentech. Mobilní fáze jsou vodné tlumivé roztoky s danou hodnotou pH.
Gelová permeační chromatografie využívá hydrofobní
ohyby a nepolární organická rozpouštědla (toluen, dichlormethan, tetra-
hydrofuran). Tato metoda se používá k analýze sloučenin, které jsou mírně rozpustné
lemované ve vodě.
Detektory. Jako detektory ve velikostní vylučovací chromatografii se používají diferenciální refraktometrické detektory a také spektrofotometrické detektory (včetně těch v IR oblasti spektra).
Používají se také viskozimetrické a průtokové laserové detektory.
Tyto detektory v kombinaci s refraktometrem nebo jinou koncentrací
detektor umožňuje průběžně určovat molekulární váha na-
vápno v PF.
ULTRA VÝKONNÁ KAPALNÁ CHROMATOGRAFIE
Ultra výkonná kapalinová chromatografie je variantou kapalinové chromatografie, která je účinnější
stu ve srovnání s klasickou HPLC.
Rysem ultravýkonné kapalinové chromatografie je
použití sorbentů s velikostí částic 1,5 až 2 mikrony. chro-
matematické sloupce mají obvykle délku 50 až 150 mm a 1
do průměru 4 mm. Objem vstřikovaného vzorku může být od 1 do 50 µl.
Chromatografické zařízení používané v klas
riante HPLC, obvykle speciálně upravená pro tento typ chromatografie
Zařízení určené pro ultravýkonnou kapalinovou chromatografii lze použít i v klasické verzi HPLC.
VŠEOBECNÉ LÉKÁRNICTVÍ
Místo Čl. GF XI
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (vysokotlaká kapalinová chromatografie) je metoda sloupcové chromatografie, ve které je mobilní fází kapalina procházející chromatografickou kolonou naplněnou stacionární fází (sorbent). Kolony pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii se vyznačují vysokým hydraulickým odporem na vstupu.
V závislosti na mechanismu separace látek se rozlišují tyto varianty vysokoúčinné kapalinové chromatografie: adsorpční, rozdělovací, iontoměničová, vylučovací, chirální atd., v souladu s povahou hlavních projevujících se mezimolekulárních interakcí. V adsorpční chromatografii dochází k separaci látek v důsledku jejich různé schopnosti adsorbovat se a desorbovat z povrchu sorbentu s vyvinutým povrchem, např. silikagelu. Při separační vysokoúčinné kapalinové chromatografii dochází k separaci v důsledku rozdílu v distribučních koeficientech separovaných látek mezi stacionární (zpravidla chemicky naroubované na povrch stacionárního nosiče) a mobilní fází.
Podle typu mobilní a stacionární fáze se rozlišuje chromatografie na normální a reverzní fázi. U vysokoúčinné kapalinové chromatografie s normální fází je stacionární fáze polární (nejčastěji silikagel nebo silikagel s naroubovanými skupinami NH 2 - nebo CN apod.), mobilní fáze je nepolární (hexan, popř. směsi hexan s polárnějšími organickými rozpouštědly - chloroform, alkoholy atd.). Zadržování látek se zvyšuje se zvyšující se polaritou. Při chromatografii na normální fázi se eluční síla mobilní fáze zvyšuje se zvyšující se polaritou.
Při chromatografii na reverzní fázi je stacionární fáze nepolární (hydrofobní silikagely s naroubovanými skupinami C4, C8, C18 atd.); mobilní fáze je polární (směsi vody a polárních rozpouštědel: acetonitril, methanol, tetrahydrofuran aj.). Retence látek se zvyšuje se zvyšováním jejich hydrofobnosti (nepolarity). Čím vyšší je obsah organického rozpouštědla, tím vyšší je eluční síla mobilní fáze.
Při iontoměničové chromatografii se molekuly směsi látek, disociované v roztoku na kationty a anionty, při pohybu sorbentem (katex nebo aniontoměnič) oddělují v důsledku různých sil interakce mezi stanovovanými ionty a iontovým iontem. skupiny sorbentu.
Při size-exkluzní (sítové, gel-penetrační, gel-filtrační) chromatografii se molekuly látek oddělují podle velikosti kvůli jejich rozdílné schopnosti pronikat do pórů stacionární fáze. V tomto případě největší molekuly, které mohou proniknout do minimálního počtu pórů stacionární fáze, opouštějí kolonu jako první a látky s malou velikostí molekul jako poslední.
Při chirální chromatografii se opticky aktivní sloučeniny dělí na jednotlivé enantiomery. Separaci lze provádět na chirálních stacionárních fázích nebo na achirálních stacionárních fázích za použití chirálních mobilních fází.
Existují další možnosti pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii.
separace často neprobíhá jedním, ale několika mechanismy současně, v závislosti na typu mobilní a stacionární fáze a také na povaze stanovované sloučeniny.
Oblast použití
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie se úspěšně používá pro kvalitativní i kvantitativní analýzu léčiv v testech "Identita", "Cizí nečistoty", "Rozpouštění", "Rovnoměrnost dávkování", "Kvantitativní stanovení". Je třeba poznamenat, že chromatografie umožňuje kombinovat několik testů v jednom vzorku, včetně "Identity" a "Kvantitativního stanovení".
Zařízení
K analýze se používají vhodné přístroje - kapalinové chromatografy.
Složení kapalinového chromatografu obvykle zahrnuje následující hlavní složky:
- přípravná jednotka mobilní fáze včetně nádoby s mobilní fází (nebo nádob s jednotlivými rozpouštědly, která jsou součástí mobilní fáze) a systému pro odplynění mobilní fáze;
— čerpací systém;
– směšovač mobilní fáze (je-li to nutné);
– systém vstřikování vzorku (injektor), může být manuální nebo automatický (autosampler);
— chromatografická kolona (může být instalována v termostatu);
— detektor (jeden nebo více s různými metodami detekce);
— řídicí systém chromatografu, sběr a zpracování dat.
Kromě toho může chromatograf obsahovat: systém pro přípravu vzorku a předkolonový reaktor, systém přepínání kolony, zakolonový reaktor a další vybavení.
Čerpací systém
Čerpadla dodávají mobilní fázi do kolony předem stanovenou rychlostí. Složení mobilní fáze a průtok mohou být konstantní nebo se mohou během analýzy měnit. V případě konstantního složení mobilní fáze se proces nazývá izokratický a ve druhém - gradient. Moderní čerpací systém kapalinového chromatografu se skládá z jednoho nebo více počítačově řízených čerpadel. To umožňuje během gradientové eluce měnit složení mobilní fáze podle konkrétního programu. Analytická vysokovýkonná kapalinová chromatografická čerpadla umožňují udržovat průtok mobilní fáze do kolony v rozsahu od 0,1 do 10 ml/min při vstupním tlaku kolony do 40 MPa. Tlakové pulsace jsou minimalizovány speciálními klapkovými systémy, které jsou součástí konstrukce čerpadel. Pracovní části čerpadel jsou vyrobeny z korozivzdorných materiálů, což umožňuje použití agresivních složek ve složení mobilní fáze.
Kohoutky
V míchačce vzniká z jednotlivých rozpouštědel dodávaných čerpadly jedna mobilní fáze, pokud požadovaná směs nebyla předem připravena. Míchání složek mobilní fáze v mísiči může probíhat jak při nízkém tlaku (před čerpadly), tak při vysokém tlaku (za čerpadly). Mixér lze použít pro přípravu mobilní fáze a izokratickou eluci.
Objem mísiče může ovlivnit retenční čas složek v gradientové eluci.
Vstřikovače
Injektory mohou být univerzální, se schopností měnit objem vstřikovaného vzorku, nebo diskrétní pro zavedení vzorku pouze o určitém objemu. Oba typy vstřikovačů mohou být automatické ("autoinjectors" nebo "auto-samplers"). Injektor vzorku (roztok) je umístěn přímo před chromatografickou kolonou. Konstrukce injektoru umožňuje změnit směr proudění mobilní fáze a předběžně zavést vzorek do dávkovací smyčky určitého objemu (obvykle od 10 do 100 μl) nebo do speciálního dávkovače s proměnným objemem. Objem smyčky je uveden na jejím označení. Konstrukce diskrétního injektoru zpravidla umožňuje výměnu smyčky. Moderní automatické vstřikovače mohou mít řadu další funkce například k plnění funkce stanice pro přípravu vzorků: k míchání a ředění vzorků, k provádění předkolonové derivatizační reakce.
Chromatografický sloupec
Chromatografické kolony jsou obvykle nerezové, skleněné nebo plastové trubice naplněné sorbentem a uzavřené na obou stranách filtry o průměru pórů 2–5 µm. Délka analytické kolony může být v rozmezí od 5 do 60 cm i více, vnitřní průměr je od 2 do 10 mm. V mikrokolonové chromatografii se používají kolony s vnitřním průměrem menším než 2 mm. Existují také kapilární kolony s vnitřním průměrem asi 0,3–0,7 mm. Kolony pro preparativní chromatografii mohou mít vnitřní průměr 50 mm nebo více.
Před analytickou kolonu lze instalovat krátké kolony (předkolony), které plní různé pomocné funkce, z nichž hlavní je ochrana analytické kolony. Typicky se analýza provádí při pokojové teplotě, avšak pro zvýšení účinnosti separace a zkrácení doby analýzy lze použít termostatování kolon při teplotách až 80–100 °C. Možnost použití zvýšené teploty při separaci je omezena stabilitou stacionární fáze, protože při zvýšených teplotách je možná její destrukce.
Stacionární fáze (sorbent)
Běžně používané sorbenty jsou:
- silikagel, oxid hlinitý, se používají v chromatografii s normální fází. Retenčním mechanismem je v tomto případě obvykle adsorpce;
- silikagel, pryskyřice nebo polymery s roubovanými kyselými nebo zásaditými skupinami. Rozsah - iontoměničová a iontová chromatografie;
- silikagel nebo polymery s danou distribucí velikosti pórů (vylučovací chromatografie);
- chemicky modifikované sorbenty (sorbenty vázané fáze), nejčastěji připravované na bázi silikagelu. Retenčním mechanismem je adsorpce nebo distribuce mezi mobilní a stacionární fází. Rozsah závisí na typu roubovaných funkčních skupin. Některé typy sorbentů lze použít jak v chromatografii na reverzní, tak v normální fázi;
- chemicky modifikované chirální sorbenty, například deriváty celulózy a amylózy, proteiny a peptidy, cyklodextriny, chitosany používané k separaci enantiomerů (chirální chromatografie).
Sorbenty vázané fáze mohou mít různé stupně chemické modifikace. Nejčastěji používané spojené fáze jsou:
– oktadecylové skupiny (sorbent oktadecylsilan (ODS) nebo C18);
– oktylové skupiny (sorbent oktylsilan nebo C 8);
– fenylové skupiny (fenylsilanový sorbent);
– kyanopropylové skupiny (CN sorbent);
– aminopropylové skupiny (sorbent NH 2);
– diolové skupiny (sorbent diol).
Nejčastěji se analýza provádí na nepolárních vázaných fázích v režimu reverzní fáze pomocí sorbentu C 18.
Sorbenty vázané fáze na bázi silikagelu jsou chemicky stabilní při hodnotách pH od 2,0 do 7,0, pokud výrobce neuvádí jinak. Částice sorbentu mohou mít kulový nebo nepravidelný tvar a různou poréznost. Velikost částic sorbentu v analytické vysokoúčinné kapalinové chromatografii je obvykle 3–10 µm, v preparativní vysokoúčinné kapalinové chromatografii je 50 µm a více. Existují také monolitické kolony, ve kterých je sorbentem monolit s průchozími póry, který vyplňuje celý objem kolony.
Vysoká separační účinnost je zajištěna vysokým povrchem částic sorbentu (což je důsledkem jejich mikroskopické velikosti a přítomnosti pórů), stejně jako stejnoměrností složení sorbentu a jeho hustým a rovnoměrným zabalením.
Detektory
Ve vysokoúčinné kapalinové chromatografii se používají různé metody detekce. V obecném případě se mobilní fáze s rozpuštěnými složkami po chromatografické koloně dostává do detektorové cely, kde je průběžně měřena ta či ona její vlastnost (absorpce v ultrafialové nebo viditelné oblasti spektra, fluorescence, index lomu, elektrická vodivost atd.). Výsledný chromatogram je grafem závislosti některého fyzikálního nebo fyzikálně-chemického parametru mobilní fáze na čase.
Nejběžnější detektory ve vysokoúčinné kapalinové chromatografii jsou spektrofotometrické. Během eluce látek ve speciálně navržené mikrobuňce se měří optická hustota eluátu při předem zvolené vlnové délce. Široký rozsah linearity detektoru umožňuje analyzovat jak nečistoty, tak hlavní složky směsi na jediném chromatogramu. Spektrofotometrický detektor umožňuje detekci při jakékoli vlnové délce v rámci svého pracovního rozsahu (typicky 190-600 nm). Používají se také vícevlnné detektory, které umožňují detekci na několika vlnových délkách současně, a detektory s diodovým polem, které umožňují záznam optické hustoty současně v celém pracovním rozsahu vlnových délek (obvykle 190–950 nm). To umožňuje zaznamenat absorpční spektra složek procházejících detekční celou.
Fluorimetrický detektor se používá k detekci fluorescenčních sloučenin nebo nefluorescenčních sloučenin ve formě jejich fluorescenčních derivátů. Princip činnosti fluorimetrického detektoru je založen na měření fluorescenční emise absorbovaného světla. Absorpce se obvykle provádí v ultrafialové oblasti spektra, vlnové délky fluorescenčního záření přesahují vlnové délky absorbovaného světla. Fluorometrické detektory mají velmi vysokou citlivost a selektivitu. Citlivost fluorescenčních detektorů je přibližně 1000krát vyšší než u spektrofotometrických. Moderní fluorescenční detektory umožňují nejen získat chromatogramy, ale také zaznamenat excitační a fluorescenční spektra analyzovaných látek.
K určení sloučenin, které slabě absorbují v ultrafialové a viditelné oblasti spektra (například sacharidy), použijte refraktometrické detektory (refraktometry). Nevýhodou těchto detektorů je jejich nízká (ve srovnání se spektrofotometrickými detektory) citlivost a značná teplotní závislost intenzity signálu (detektor musí být termostatovaný) a také nemožnost použití v režimu gradientní eluce.
Princip činnosti odpařovací laserové detektory rozptylu světla je založen na rozdílu tenzí par chromatografických rozpouštědel tvořících mobilní fázi a analyzovaných látek. Mobilní fáze na výstupu z kolony je zavedena do nebulizéru, smíchána s dusíkem nebo CO 2 a ve formě jemně rozptýleného aerosolu vstupuje do vyhřívané trubice výparníku o teplotě 30–160 °C, ve které mobilní fáze se odpaří. Aerosol netěkavých částic analyzovaných látek rozptyluje světelný tok v disperzní komoře. Podle stupně disperze světelného toku lze posoudit množství stanovené sloučeniny. Detektor je citlivější než refraktometrický, jeho signál nezávisí na optických vlastnostech vzorku, na typu funkčních skupin v analytech, na složení mobilní fáze a lze jej použít v režimu gradientní eluce .
Elektrochemické detektory (konduktometrické, amperometrické, coulometrické atd.). Amperometrický detektor se používá k detekci elektroaktivních sloučenin, které mohou být oxidovány nebo redukovány na povrchu pevné elektrody. Analytický signál je velikost oxidačního nebo redukčního proudu. Detekční článek má minimálně dvě elektrody - pracovní elektrodu a referenční elektrodu (chlorid stříbrný nebo ocel). Na elektrody je aplikován provozní potenciál, jehož hodnota závisí na povaze stanovovaných sloučenin. Měření lze provádět jak při konstantním potenciálu, tak v pulzním režimu, kdy se nastavuje profil změny potenciálu pracovní elektrody během jednoho cyklu záznamu signálu. Amperometrický detektor využívá pracovní elektrody z uhlíkových materiálů (nejčastěji skelného uhlíku nebo grafitu), a kovu: platina, zlato, měď, nikl.
Konduktometrický detektor se používá k detekci aniontů a kationtů v iontové chromatografii. Princip jeho činnosti je založen na měření elektrické vodivosti mobilní fáze při eluci látky.
Výjimečně informativní je hmotnostní spektrometrický detektor, který má vysokou citlivost a selektivitu. Nejnovější modely hmotnostních spektrometrů pro kapalinovou chromatografii pracují v hmotnostním rozsahu m/z od 20 do 4000 amu.
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie využívá také Fourier-IR detektory, radioaktivitu a některé další.
Systém sběru a zpracování dat
Moderní systém zpracování dat je osobní počítač připojený k chromatografu s nainstalovaným softwarem, který umožňuje registrovat a zpracovávat chromatogram, stejně jako řídit provoz chromatografu a sledovat hlavní parametry chromatografického systému.
Mobilní fáze
Mobilní fáze ve vysokoúčinné kapalinové chromatografii plní dvojí funkci: zajišťuje přenos desorbovaných molekul podél kolony a reguluje rovnovážné konstanty a následně retenci v důsledku interakce se stacionární fází (která je sorbována na povrchu ) a s molekulami separovaných látek. Změnou složení mobilní fáze ve vysokoúčinné kapalinové chromatografii lze tedy ovlivnit retenční časy sloučenin, selektivitu a účinnost jejich separace.
Mobilní fáze může sestávat z jednoho rozpouštědla, často dvou, v případě potřeby tří nebo více. Složení mobilní fáze se udává jako objemový poměr rozpouštědel, které tvoří její složky. V některých případech může být uveden hmotnostní poměr, který by měl být speciálně stanoven. Jako složky mobilní fáze lze použít pufrovací roztoky s určitou hodnotou pH, různé soli, kyseliny a zásady a další modifikátory.
Chromatografie na normální fázi obvykle používá kapalné uhlovodíky (hexan, cyklohexan, heptan) a další relativně nepolární rozpouštědla s malým přídavkem polárních organických sloučenin, které řídí eluční sílu mobilní fáze.
Při chromatografii na reverzní fázi se jako mobilní fáze používá voda nebo vodně-organické směsi. Organické přísady jsou obvykle polární organická rozpouštědla (acetonitril a methanol). Pro optimalizaci separace lze použít vodné roztoky s určitou hodnotou pH, zejména roztoky pufrů, a také různé přísady do mobilní fáze: kyseliny fosforečné a octové při separaci kyselých sloučenin; amoniak a alifatické aminy při separaci bazických sloučenin a další modifikátory.
Čistota mobilní fáze značně ovlivňuje chromatografickou analýzu, proto je výhodné používat rozpouštědla uvolněná speciálně pro kapalinovou chromatografii (včetně vody).
Při použití UV spektrofotometrického detektoru by mobilní fáze neměla mít výraznou absorpci při vlnové délce zvolené pro detekci. Na obalu je často uveden limit průhlednosti nebo optické hustoty při určité vlnové délce rozpouštědla konkrétního výrobce.
Mobilní fáze a analyzované roztoky nesmí obsahovat nerozpuštěné částice a bublinky plynu. Voda získaná v laboratorních podmínkách, vodné roztoky, organická rozpouštědla předem smíchaná s vodou, jakož i analyzované roztoky musí být podrobeny jemné filtraci a odplynění. Pro tyto účely se obvykle používá vakuová filtrace přes membránový filtr o velikosti pórů 0,45 μm, který je inertní vůči danému rozpouštědlu nebo roztoku.
Seznam chromatografických podmínek, které mají být specifikovány
Monografie by měla obsahovat: úplný obchodní název kolony s uvedením výrobce a katalogové číslo, rozměry kolony (délka a vnitřní průměr), typ sorbentu, označení velikosti částic, velikost pórů, teplotu kolony (pokud je nutná kontrola teploty), objem vstřikovaného vzorku (objemové smyčky), složení mobilní fáze a způsob její přípravy, rychlost posuvu mobilní fáze, typ detektoru a podmínky detekce (v případě potřeby parametry použité detektorové cely), popis gradientového režimu (pokud je použit) včetně fáze opětovného uvedení do rovnováhy na výchozí podmínky, doby chromatografie, Detailní popis metody a výpočtové vzorce, popisy přípravy standardních a zkušebních roztoků.
Pokud je v autosampleru použita derivatizace před sloupcem, jsou poskytnuty informace o programu autosampleru. V případě použití postkolonové derivatizace se uvádí rychlost přísunu derivatizačního činidla, objem směšovací smyčky a její teplota.
Modifikovaná vysoce výkonná kapalinová chromatografie
Chromatografie na iontových párech
Jednou z odrůd vysokoúčinné kapalinové chromatografie s reverzní fází je iontová párová chromatografie – která umožňuje stanovit ionizované sloučeniny. K tomu se do tradiční vysokoúčinné kapalinové chromatografie mobilní fáze s reverzní fází přidávají hydrofobní organické sloučeniny s ionogenními skupinami (iontová párová činidla). K separaci bází se obvykle používají alkylsulfáty sodné, k separaci kyselin tetraalkylamoniové soli (tetrabutylamonium fosfát, cetyltrimethylamonium bromid aj.). V režimu iontových párů bude selektivita separace neiontových složek omezena retenčním mechanismem na reverzní fázi, přičemž retence zásad a kyselin se výrazně zvyšuje, zatímco tvar chromatografických píků se zlepšuje.
Retence v režimu iontových párů je způsobena poměrně složitými rovnovážnými procesy, které spolu soutěží. Na jedné straně je díky hydrofobním interakcím a vlivu vytěsnění polárního prostředí mobilní fáze možná sorpce hydrofobních iontů na povrchu alkylsilikagelu tak, že nabité skupiny směřují k mobilní fázi. V tomto případě povrch získává iontově výměnné vlastnosti a retence se řídí zákony iontoměničové chromatografie. Na druhé straně je možné vytvořit iontový pár přímo v objemu eluentu s následnou jeho sorpcí na sorbent mechanismem reverzní fáze.
Hydrofilní interakční chromatografie ( HILIC chromatografie)
Hydrofilní interakční chromatografie se používá k separaci polárních sloučenin, které se špatně zadržují ve vysoce výkonné kapalinové chromatografii s reverzní fází. Jako mobilní fáze se v této variantě chromatografie používají směsi voda-acetonitril s přídavkem solí, kyselin nebo zásad. Stacionární fáze jsou zpravidla silikagely modifikované polárními skupinami (aminoskupiny, diolové, kyanopropylové skupiny atd.). Polární sloučeniny jsou pevnější. Eluční síla mobilní fáze se zvyšuje se zvyšující se polaritou.
Iontová výměna a iontová vysokoúčinná kapalinová chromatografie
Iontově výměnná chromatografie se používá k analýze organických (heterocyklické báze, aminokyseliny, proteiny atd.) i anorganických (různé kationty a anionty) sloučenin. Separace složek analyzované směsi v iontoměničové chromatografii je založena na reverzibilní interakci iontů analyzovaných látek s iontoměničovými skupinami sorbentu. Těmito sorbenty jsou převážně buď polymerní iontoměničové pryskyřice (obvykle kopolymery styrenu a divinylbenzenu s naroubovanými iontoměničovými skupinami) nebo silikagely s naroubovanými iontoměničovými skupinami. K separaci aniontů (aniontoměničů) se používají sorbenty se skupinami: -NH 3 +, -R 3 N +, -R 2 HN +, -RH 2 N + atd. a sorbenty se skupinami: -SO 3 -, - RSO 3 -, -COOH, -PO 3 - a další pro separaci kationtů (katexy).
Jako mobilní fáze v iontoměničové chromatografii se používají vodné roztoky kyselin, zásad a solí. K udržení určitých hodnot pH se obvykle používají roztoky pufrů. Je také možné použít malé přísady organických rozpouštědel mísitelných s vodou - acetonitril, methanol, ethanol, tetrahydrofuran.
Iontová chromatografie - varianta iontoměničové chromatografie, při které se k detekci analytů (iontů) používá konduktometrický detektor. Pro vysoce citlivé stanovení změn vodivosti mobilní fáze procházející detektorem musí být vodivost pozadí mobilní fáze nízká.
Existují dvě hlavní varianty iontové chromatografie.
První z nich, dvousloupcová iontová chromatografie, je založena na potlačení elektrické vodivosti elektrolytu mobilní fáze pomocí druhé iontoměničové kolony nebo speciálního membránového supresního systému umístěného mezi analytickou kolonou a detektorem. Při průchodu systémem se elektrická vodivost mobilní fáze snižuje.
Druhou variantou iontové chromatografie je jednokolonová iontová chromatografie. Tato varianta využívá mobilní fázi s velmi nízkou elektrickou vodivostí. Jako elektrolyty se široce používají slabé organické kyseliny: benzoová, salicylová nebo isoftalová.
Vysoce výkonná kapalinová chromatografie s vyloučením velikosti
Velikostní vylučovací chromatografie (gelová chromatografie) je speciální verze vysokoúčinné kapalinové chromatografie založená na separaci molekul podle jejich velikosti. Rozdělení molekul mezi stacionární a mobilní fázi je založeno na velikosti molekul a částečně na jejich tvaru a polaritě.
Jsou možné dva limitující typy interakce molekul s porézní stacionární fází. Molekuly větší než maximální průměr pórů nejsou vůbec zadržovány a jsou eluovány jako první, přičemž se pohybují spolu s mobilní fází. Molekuly s velikostí menší než je minimální průměr pórů sorbentu volně pronikají do pórů a jsou z kolony eluovány jako poslední. Zbývající molekuly, které mají střední velikost, jsou částečně zadrženy v pórech a během eluce jsou rozděleny do frakcí podle jejich velikosti a částečně tvaru, pronikají do pórů sorbentu v závislosti na velikosti a částečně v závislosti na jejich tvaru. V důsledku toho jsou látky eluovány s různými retenčními časy.
Iontově vylučovací chromatografie
Mechanismus iontově-vylučovací chromatografie je založen na efektu, v jehož důsledku se sloučeniny v ionizované formě nezadržují na iontoměničovém sorbentu, zatímco sloučeniny v molekulární formě jsou distribuovány mezi stacionární a vodnou fázi uvnitř pórů. iontoměničového sorbentu a mobilní fáze migrující v prostoru mezi částicemi sorbentu. Separace je založena na elektrostatickém odpuzování, polárních a hydrofobních interakcích mezi rozpuštěnými sloučeninami a sorbentem.
Aniontové skupiny na povrchu sorbentu působí jako semipermeabilní „membrána“ mezi stacionární a mobilní fází. Záporně nabité složky se nedostanou do stacionární mobilní fáze, protože jsou odpuzovány podobně nabitými funkčními skupinami a eluovány v "mrtvém" (volném) objemu kolony. Složky v molekulární formě nejsou kationtoměničovým sorbentem „odmítány“ a jsou distribuovány mezi stacionární a mobilní fázi. Rozdíl ve stupni retence neiontových složek směsi je dán kombinací polárních interakcí neiontových složek s funkčními skupinami katexového sorbentu a hydrofobních interakcí neiontových složek s neiontovými složkami. - matrice polárního sorbentu.
Chirální chromatografie
Cílem chirální chromatografie je separace optických izomerů. Separace se provádí na chirálních stacionárních fázích nebo na konvenčních achirálních stacionárních fázích za použití chirálních mobilních fází. Jako chirální stacionární fáze se používají sorbenty s upraveným povrchem, skupiny nebo látky s chirálními centry (chitosan, cyklodextriny, polysacharidy, proteiny apod. (chirální selektory). V tomto případě lze jako mobilní fáze použít stejné fáze jako v chromatografie na normální fázi nebo na reverzní fázi.Při použití achirálních stacionárních fází k zajištění separace enantiomerů se do mobilních fází přidávají chirální modifikátory: chirální kovové komplexy, neutrální chirální ligandy, chirální iontové páry, atd.
Ultra výkonná kapalinová chromatografie
Ultra výkonná kapalinová chromatografie je variantou kapalinové chromatografie, která je účinnější než klasická vysokoúčinná kapalinová chromatografie.
Charakteristickým rysem ultravýkonné kapalinové chromatografie je použití sorbentů s velikostí částic 1,5 až 2 µm. Chromatografické kolony jsou typicky 50 až 150 mm dlouhé a 1 až 4 mm v průměru. Objem vstřikovaného vzorku může být od 1 do 50 µl. Použití takových chromatografických kolon může významně zkrátit dobu analýzy a zlepšit účinnost chromatografické separace. V tomto případě však může tlak na kolonu dosáhnout 80–120 MPa, požadovaná frekvence sběru dat detektoru se může zvýšit až na 40–100 Hz a extrakolonový objem chromatografického systému musí být minimalizován. Chromatografické zařízení a kolony používané v ultra vysokoúčinné kapalinové chromatografii jsou speciálně upraveny tak, aby splňovaly požadavky tohoto typu chromatografie.
Zařízení určené pro ultraúčinnou kapalinovou chromatografii lze použít i v klasické vysokoúčinné kapalinové chromatografii.
Úvod
Chromatografická analýza je kritériem pro homogenitu látky: pokud analyzovaná látka není separována žádnou chromatografickou metodou, je považována za homogenní (bez nečistot).
Zásadním rozdílem mezi chromatografickými metodami a ostatními fyzikálně chemickými metodami analýzy je možnost separace látek s podobnými vlastnostmi. Po separaci lze složky analyzované směsi identifikovat (nastavit povahu) a kvantifikovat (hmotnost, koncentrace) libovolnými chemickými, fyzikálními a fyzikálně-chemickými metodami.
Chromatografie je široce používána v laboratořích a průmyslu pro kvalitativní a kvantitativní analýzu vícesložkových systémů, řízení výroby, zejména v souvislosti s automatizací mnoha procesů, jakož i pro preparativní (včetně průmyslové) izolace jednotlivých látek (např. kovy), separace vzácných a rozptýlených prvků.
Podle stavu agregace eluentu se rozlišuje plynová (GC, GC) a kapalinová chromatografie (HPLC, HPLC).
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC, HPLC) se používá k analýze, separaci a čištění syntetických polymerů, léčiv, detergentů, proteinů, hormonů a dalších biologicky důležitých sloučenin. Použití vysoce citlivých detektorů umožňuje pracovat s velmi malým množstvím látek (10 -11 -10 -9 g), což je v biologickém výzkumu mimořádně důležité.
Metoda HPLC se provádí na různých kapalinových chromatografech. Moderní kapalinové chromatografy jsou navrženy tak, aby rozdělovaly složité směsi látek na jednotlivé složky a prováděly kvalitativní a kvantitativní analýzu složek separované směsi.
vysokoúčinná kapalinová chromatografie propyfenazon
V souvislosti se zavedením GMP do praxe farmaceutické výroby v Rusku. roste význam používání moderních jednotných metod analýzy jak ve výrobních podnicích, tak v systému státní kontroly kvality léčiv. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) je základní metodou pro analýzu kvality látek a hotových léčivých přípravků v zemích s rozvinutým farmaceutickým průmyslem (USA, Anglie, Japonsko, země EU). Tato metoda svými vlastnostmi splňuje požadavky na kvantitativní analýzu asi 80-90 % léčiv.
Technika provádění jakýchkoliv chromatografických stanovení podléhá určitým Obecné požadavky. Nejprve je třeba poznamenat ty z nich, které mezi začátečníky vyvolávají nejvíce otázek.
1. Klimatizace. V místnosti, kde je kapalinový chromatograf instalován, by nemělo docházet k prudkým teplotním výkyvům.
Změny teploty mohou vést ke změnám retence, účinnosti a dokonce i selektivity separace.
V letních vedrech je v neklimatizovaných místnostech velmi obtížné pracovat s normálními fázemi lehce vroucími mobilními fázemi. Během dne se postupně odpařují, což vede ke změně složení eluentu.
Při nižších teplotách vznikají problémy při práci s eluenty obohacenými vodou a/nebo obsahujícími alkoholy. Viskozita takových eluentů prudce roste s klesající teplotou, což vede ke zvýšení tlaku v systému.
Vliv malých teplotních výkyvů na separaci lze eliminovat termostatováním chromatografické kolony, případně celého kapalného systému (což není možné u všech chromatografů).
2. Kvalita napájení. Většina moderních chromatografů je vybavena systémy stabilizace výkonu, vysoká musí být však i kvalita místního napájení. Pokud zdroj napájení není dostatečně dobrý, může selhat jakýkoli běh řady definic v automatickém režimu kvůli poruše.
3. Čistota rozpouštědel. Pro přípravu mobilních fází by měla být použita vysoce čistá rozpouštědla.
Obecně platí, že požadavky na čistotu mobilní fáze závisí na způsobu detekce, způsobu eluce (izokratické nebo gradientní), citlivosti detektoru na cílový analyt a jeho koncentraci.
Při použití UV detekce rostou požadavky na čistotu rozpouštědel s přechodem do oblasti krátkých vlnových délek, méně než 230–240 nm. Pro izokratickou eluci s UV detekcí při vlnových délkách větších než 220-240 nm lze použít rozpouštědla stupně "vysoké čistoty". a destilovanou vodou. Všechna činidla přidaná do mobilní fáze musí být rovněž dostatečně čistá; je užitečné rekrystalizovat krystalická činidla před použitím.
Gradientová eluce vyžaduje rozpouštědla stupně "pro kapalinovou chromatografii" a bidestilovanou vodu. Speciální požadavky při gradientové eluční metodě (v chromatografii na reverzní fázi) jsou kladeny na čistotu vodného pufru a zejména vody. Především je to způsobeno tím, že v počáteční fázi eluce adsorbent absorbuje znečišťující složky z mobilní fáze obohacené o vodný pufr, které se následně eluují a na chromatogramu se objevují ve formě „hrbů“, „prahy“ a jednotlivé píky, které značně komplikují extrakci užitečných signálů analytu.
Pro dávkové stanovení stopových množství látek v gradientovém elučním režimu jsou vyžadována nejčistší rozpouštědla.
Pro provedení stanovení v gradientovém elučním režimu, stejně jako precizní stanovení v izokratickém režimu, musí být mobilní fáze aplikována jednou, to znamená, že eluát musí být zlikvidován nebo zlikvidován.
Při izokratické eluci, pokud neexistují žádné zvláštní problémy s citlivostí, lze vyčerpaný eluent znovu použít. Systém, ve kterém se eluát po průchodu detektorem vrací do nádoby s mobilní fází, se nazývá "recyklační systém". Takový systém je zvláště užitečný v případě velkého počtu rutinních izokratických stanovení na standardních kolonách (250x4,6, 150x4,6) při průtoku asi 1 ml/min. V těchto případech recyklační systém ušetří až 200-300 ml organického rozpouštědla denně. Tento ekonomický systém umožňuje použití velmi čistých, drahých rozpouštědel pro analýzu. Otázka úspory drahých rozpouštědel je méně akutní v případě použití mikrokolon (80x2, 100x2), protože separace vyžaduje řádově menší objem mobilní fáze.
4. Odplynění rozpouštědel. Rozpouštědla používaná v chromatografii k přípravě mobilních fází obvykle obsahují rozpuštěný vzduch. Zejména hodně vzduchu obsahuje vodu.
Při práci s neodplyněnými eluenty se vzduchové bubliny dostávají do různých součástí kapalného systému: čerpadlo, kolona, kapiláry, detektor. Když vzduch vstoupí do kapalinového systému, objeví se na chromatogramu vysoké periodické zvuky způsobené kolísáním tlaku v kapalinovém systému. To vede k prudkému poklesu citlivosti analýzy.
Aby se odstranil vzduch z jejich eluentu, je odplyněn. Zpravidla se odplyňují pouze eluční činidla pro separaci reverzních fází - protože vodně-organické směsi obsahují značné množství rozpuštěného vzduchu. Zvláště pečlivé odplynění musí být provedeno v případě gradientové eluce, stejně jako při použití fluorimetrické detekce.
Při gradientové eluci v režimu reverzní fáze se mísí dva eluenty - voda-organické směsi různého složení. Míchání neodplyněných eluentů vede k intenzivnímu uvolňování rozpuštěného vzduchu, což je kritické pro stanovení jako celek (vzduchové bubliny jsou v chromatogramu zaznamenány jako ostré "emise" na nulové čáře).
Citlivost fluorimetrické detekce klesá při vysokém obsahu rozpuštěného vzduchu v mobilní fázi (fluorescence je zhášena). Při použití fluorimetrické detekce je tedy třeba věnovat zvláštní pozornost odplynění eluentu.
Existují tři hlavní způsoby odplynění mobilních fází pro kapalinovou chromatografii.
A. Vakuové odplynění - eluent se několik minut udržuje v Claisenově baňce pod vakuem vodní vývěvy. Během odplyňování je třeba se vyvarovat varu eluentu.
b. Termické odplynění se používá k odplynění vodně-organických eluentů s vysokým podílem vody. Mobilní fáze se umístí do baňky, která není hermeticky uzavřena, a ponechá se ve vodní lázni o teplotě asi 50 °C. Po 10-15 minutách se baňka uzavře zátkou a ochladí se pod tekoucí vodou na pokojovou teplotu.
v. Odplynění ultrazvukem. Mobilní fáze je sonikována po dobu několika minut a poté ponechána usadit se po dobu 10-15 minut. Tato metoda často není dostatečně účinná pro odplynění voda-organické eluenty.
Moderní čerpací systémy pro kapalinovou chromatografii jsou vybaveny automatickými odplyňovacími systémy. Při provádění gradientových rozborů je však lepší obě mobilní fáze odplynit předem a „ručně“, podle některé z výše uvedených metod.
5. Filtrace mobilní fáze. Pro zajištění bezporuchového provozu čerpadla je žádoucí filtrovat mobilní fázi ve vakuu pomocí membránového filtru.
6. Promývání kolony a komponent kapalného systému. Po práci s vodnými organickými mobilními fázemi obsahujícími soli a kyseliny by měl být celý kapalný systém (včetně kolony) promyt destilovanou vodou s přídavkem 5-10% organického rozpouštědla. Takové proplachování se provádí tak, aby se v mimopracovních hodinách dodatečně neopotřebovávaly komponenty kapalinového systému chromatografu a samotná stacionární fáze.
Neprovedení takového promývání vede především k tomu, že po zastavení čerpadla dochází k usazování solí z eluentu na jeho částech a na stěnách kyvety detektoru. To zase vede k nestabilnímu provozu zařízení jako celku a také k předčasnému opotřebení pohyblivých částí čerpadla. Pravidelné neproplachování systému eluentů obsahujících sůl a kyseliny může vést ke zkrácení životnosti stacionární fáze.
Přidání určitého množství organického rozpouštědla do promývací vody je nezbytné, aby se zabránilo biologické kontaminaci systému kapalin.
7. Přechod do nové mobilní fáze, která se nemísí s předchozí. Takový přechod se provádí přes meziproduktové rozpouštědlo, které je nekonečně mísitelné s oběma mobilními fázemi - obvykle přes isopropanol nebo aceton.
Pro přechod z vodného eluentu na nepolární eluent by měl být kapalný systém promyt vodou s přídavkem organického rozpouštědla, poté by měla být odstraněna chromatografická kolona, systém by měl být promyt isopropanolem (aceton), systém by měl být promyjte nepolárním eluentem a měla by být instalována nová kolona.
Pro reverzní přechod se chromatografická kolona odstraní, kapalný systém se promyje isopropanolem (acetonem), poté vodným elučním činidlem a poté se nainstaluje nová kolona.
Při přechodu z vodného na nepolární eluent se ujistěte, že materiál těsnění čerpadla je určen pro nepolární rozpouštědla.
8. Filtrace vzorku. Pokud analyzovaný vzorek obsahuje nerozpuštěnou suspenzi, je žádoucí ji filtrovat průchodem vzorku přes membránový filtr připojený k injekční stříkačce. Bohužel, pokud je vzorek malý, méně než mililitr, je téměř nemožné jej tímto způsobem filtrovat.
Při pravidelné analýze vzorků obsahujících nerozpuštěné látky může dojít k ucpání vstupního filtru na koloně (frita), což povede především ke zvýšení tlaku v systému. V tomto případě je lepší vyměnit vstupní filtr, a pokud není výměna, omýt jej v organickém rozpouštědle sonikací po dobu 10-15 minut.
Nejoptimálnějším řešením problému je použití in-line filtru před kolonu. In-line filtr obsahuje vyměnitelnou fritu - stejnou jako na koloně. Výměna frity na in-line filtru je rutinní operace, kterou lze provádět poměrně často.
9. Aplikace ochranných sloupů. Při pravidelné analýze "špinavých" vzorků se chromatografická kolona rychle kontaminuje a ztrácí svou separační schopnost. Známou alternativou k důkladné přípravě vzorku je v tomto případě použití ochranné kolony, která chrání hlavní kolonu před kontaminací.
Někdy je účelné neprovádět přípravu vzorku vůbec, ale vložit in-line filtr a předkolonu do řady před hlavní kolonu. Výhodou tohoto schématu je jednoduchost a rychlost analýz s menší prací a reagenciemi.
10. Konzervace chromatografických kolon. Před dostatečně dlouhým skladováním se chromatografické kolony promyjí a naplní rozpouštědlem, které je zcela specifické pro každý typ stacionární fáze.
Chromatografické kolony pro provoz v systémech s normální fází jsou tedy obvykle plněny vysokovroucími uhlovodíky, jako je isooktan. Reverzní fáze se promyjí vodou a naplní acetonitrilem nebo při nízké rychlosti přivádění isopropanolu. Fáze určené pro provoz s vodnými pufry jsou naplněny vodou s malým přídavkem azidu sodného (bakteriostatický).
Pokyny pro skladování kolony mohou být uvedeny v jejím pasu.
11. Skladování vodních pufrů. V případě rutinního stanovení může být docela vhodné připravit najednou velký objem vodného pufru pro přípravu mobilní fáze. Bohužel, vodný pufr nemůže být skladován déle než několik dní, pokud k němu není přidán azid sodný, bakteriostatikum. Mobilní fáze na bázi fosfátového pufru se velmi špatně skladují.
Někdy se připravuje velký objem vodného pufru, aby se "zvýšila reprodukovatelnost testu". Obecně řečeno, s tímto přístupem se nezvyšuje reprodukovatelnost analýzy, ale problémy s ukládáním do vyrovnávací paměti se zdají nevyhnutelné.
Obecně lze říci, že odpovědí na otázku je, zda připravovat zásobník vody na týden nebo na jeden den? - je určeno výhradně zásadou pohodlí.
12. Pravidelnost kalibrace. Standardní kalibrace se zpravidla provádí každý den nebo pokaždé, když se připravuje nový eluent.
Kalibrace se provádí při dosažení stacionárního stavu chromatografického systému; odečitatelné parametry jsou retenční čas standardního píku, jeho plocha (v případě spektrofotometrické detekce - na referenční vlnové délce), spektrální poměry (při použití skenovacího nebo diodově-maticového spektrofotometrického detektoru).
Na začátku práce lze standard analyzovat dvakrát - pro potvrzení reprodukovatelnosti retenčního času.
1. Stanovení složek přípravku "BICILLIN-3" pomocí HPLC
Bicillin-3 je dlouhodobě působící penicilin a je směsí sodných, novokainových a benzathinových solí benzylpenicilinu (BP). Podle aktuálního VFS 42-3034-98 se stanovení BP v přípravku provádí pomocí HPLC, novokain se stanoví spektrofotometricky a benzathin (N,N1-dibenzylethylendiamin) se extrahuje etherem z vodného roztoku nasyceného chloridem sodným. . Po odpaření etheru se benzathin stanoví titrací kyselinou chloristou.
V Evropském lékopisu se obsah BP a benzathinu v benzathinové soli BP stanovuje pomocí gradientové HPLC ve směsi methanolu s roztokem fosforečnanu sodného při pH 3,5.
Účelem této práce je vyvinout HPLC metodu v izokratickém režimu pro stanovení složek v bicilinu-3.
experimentální část
Byl použit bicillin-3 vyráběný společností AKO Sintez (Kurgan). Studie byla provedena na Waters chromatografu (USA) s pumpou model 510, UV detektorem model 481 a injektorem model 7125 (Rheodyne) s dávkovací smyčkou o objemu 50 ul. Pro detekci byla použita vlnová délka 214 nm, při které jsou všechny analyzované sloučeniny dobře detekovány. Registrace chromatogramů a výpočet ploch píků a hlavních retenčních parametrů byl proveden pomocí osobního počítače s analogově-digitálním převodníkem a programem Multichrome.
Metoda HPLC s reverzní fází byla studována na koloně Luna C18 (2) 250 x 4,6 mm od společnosti Phenomenex (USA), protože kolona se dříve ukázala jako relativně levná se zlepšenou symetrií výtěžku píku organických aminů. Za stejným účelem byla jako mobilní fáze použita směs acetonitrilu s tlumivým roztokem obsahujícím triethylamin jako jednu ze složek o pH 5,0.
Výchozí roztok pro přípravu mobilní fáze - 2,5M roztok kyseliny fosforečné, který byl titrován triethylaminem na pH 5,0. Roztok pufru pro HPLC byl připraven zředěním zásobního roztoku 10x vodou, 750 ml získaného roztoku pufru bylo smícháno s 250 ml acetonitrilu. Současně se zdánlivé pH mobilní fáze zvýšilo na 5,7. Rychlost mobilní fáze 1 ml/min. Chromatografie byla prováděna při teplotě místnosti. Doba analýzy 20 min.
Vzhledem k tomu, že složky léčiva se liší acidobazickými vlastnostmi - BP je kyselina a novokain a benzathin jsou zásady, se zvýšením pH se jejich retenční časy v oblasti pH, kde se mění jejich ionizace, posouvají různými směry. Změnou pH je tedy snadné zvolit vhodnou retenci analyzovaných složek. Zvýšení pH však vede ke znatelnému zhoršení tvaru benzathinového píku, zatímco snížení vede k nedostatečnému rozlišení produktů hydrolýzy novokainu a BP. Separace složek bicilinu-3 za výše uvedených podmínek je znázorněna na obrázku. Retenční časy novokainu, benzathinu a BP byly 4,2, 11,6 a 14,8 min.
Významný je výstup píku novokainu mezi 2 píky, které jsou produkty hydrolýzy BP. V tomto ohledu se pro lepší separaci složek doporučuje přidávat do mobilní fáze malá množství 2,5 M roztoků kyseliny fosforečné nebo triethylaminu a separaci řídit chromatografií směsi novokainu a BP, jejíž roztok byl uchovávat asi den při pokojové teplotě.
Pro kvantitativní stanovení bylo 20–25 mg bicilinu-3 přidáno do 100 ml odměrné baňky a rozpuštěno ve 20% vodném roztoku acetonitrilu. Použití methanolu nebo jeho roztoků k rozpuštění vedlo k částečné methylaci BP. Zvýšení koncentrace acetonitrilu vedlo k rozšíření píku novokainu. Horní limit Koncentrace léčiva je omezena jeho rozpustností. Kalibrační grafy pro BP a benzathin byly získány za použití sodné soli BP a benzathin diacetátu po příslušné konverzi. Kalibrační křivka pro BP je lineární v oblasti 0,1-0,5 mg/ml, pro benzathin a novokain - v oblasti 0,01-0,05 mg/ml. Výsledky stanovení složek v 5 sériích léčiva jsou uvedeny v tabulce 1, kde každá hodnota je průměrem z 5 stanovení. Relativní směrodatná odchylka byla 1,6 % pro novokain, 3,4 % pro benzathin a 1,4 % pro BP.
Z tabulky 1 vyplývá, že výsledky kvantitativního stanovení pomocí HPLC se vešly do přípustných limitů regulovaných ND.
Pro potvrzení správnosti navržené metody byly složky bicilinu-3 analyzovány v modelových směsích připravených smícháním sodné soli BP, benzathin diacetátu a novokainu. Výsledky jsou uvedeny v tabulce.2. Výsledky jsou přepočítány na původní komponenty.
Každá hodnota ve sloupci "Nalezeno" v tabulce 2 je průměrným výsledkem 3 stanovení. Průměrná relativní odchylka byla 2,2 % pro benzathin, 0,9 % pro novokain a 0,8 % pro BP, což koreluje s relativními středními standardními odchylkami zjištěnými při analýze složek v reálných vzorcích. U benzathinu je rozptyl výsledků poněkud vyšší než u ostatních složek, což se vysvětluje nízkou výškou a nepravidelný tvar vrchol a v důsledku toho větší integrační chyba. Další důvod týkající se velké chyby při stanovení benzathinu se může při analýze silně adsorbovaných látek objevit paměťový efekt injektoru. Avšak i takový rozptyl, mírně přesahující rozptyl akceptovaný pro analýzy metodou HPLC, je pro stanovení benzathinu zcela přijatelný.
závěry
1. Byla vyvinuta technika pro detekci a kvantitativní stanovení složek v přípravku "Bicilin-3".
2. Technika byla testována na řadě šarží léčiva a potvrzena analýzou modelových směsí známého složení.
2. HPLC při analýze přípravků obsahujících propyfenazon
Propyfenazon (4-isopropyl-2,3-dimethyl-1-fenyl-3-pyrazolin-5-on; isopropylantipyrin) patří mezi nenarkotická analgetika řady pyrazolonů a je součástí kombinovaných volně prodejných léků. V současné době jsou v lékařské praxi široce používány kofetinové tablety (složení: propyfenazon-0,21 g, paracetamol-0,25 g, kofein-0,05 g, kodeinfosfát-0,01 g) a saridon (paracetamol-0,25 g, propyfenazon-0,15 g, kofein-0. G). Podle stávající regulační dokumentace se k potvrzení pravosti kofetinových tablet používá chromatografie v tenké vrstvě sorbentu. Kvantitativní stanovení se navrhuje provádět v oddělených navážených dávkách léčiva za použití metod odlišných pro každou složku: pomocí spektrofotometrie, titrimetrie, kombinace chromatografie na tenké vrstvě a spektrofotometrie. V regulační dokumentaci pro saridon, paracetamol, kofein a propyfenazon jsou stanoveny pomocí HPLC na kolonách dlouhých 12,5 cm se sorbentem Merck Lichrospher C18 a mobilní fází o složení: methanol-0,01 M kyselina fosforečná v poměru 30:70.
Účelem této práce je vyvinout metody pro detekci a kvantifikaci složek kofetinových a saridonových tablet pomocí HPLC.
Použili jsme tablety kofetinu z produkce Alkaloid Skopje (Makedonská republika), saridon z Roche Nicholas S.A. Laboratories, Gaillard (Francie) a látky jejich složek. Studie byla provedena na domácím mikrokolonovém kapalinovém chromatografu "Milichrom-4" s UV spektrofotometrickým detektorem, kolona dlouhá 8 cm se sorbentem s reverzní fází Separon-C18 jako stacionární fází. Polární povaha analyzovaných sloučenin, jejich dobrá rozpustnost ve vodě a acetonitrilu vedla k volbě směsí voda-acetonitril v různých poměrech jako mobilní fáze. Mobilní fáze byly testovány acetonitril - voda v poměru 9:1; 7:3; 6:4; 8:2 a acetonitril-voda-diethylamin (3:2:0,2). Bylo zabráněno použití mobilních fází s objemovým podílem organického rozpouštědla vyšším než 80 %, aby se vyloučily interakce normální fáze, které znesnadňují další kontrolu složení mobilní fáze. Objemový podíl rozpouštědla menší než 5 % vede k funkční nestabilitě mobilní fáze a nereprodukovatelnosti retenčních časů. Zavedení dietylaminu jako modifikátoru do složení mobilní fáze umožnilo oddělit všechny 4 složky kofetinových tablet. Je známo, že na povrchu oktadecylsilikagelu je značné množství zbytkových silanolových skupin schopných iontově výměnné interakce. Diethylamin odstraňuje silanolové skupiny z chromatografického procesu, zlepšuje tvar píku, zkracuje dobu analýzy a reguluje pH na povrchu silikagelu. Měření bylo provedeno za následujících podmínek: registrační stupnice 2,0, retenční čas 0,8 s, průtok eluentu 50 μl/min, objem nástřiku vzorku 3 μl. Detekce píku byla provedena při 2 vlnových délkách - 238 a 276 nm.
Identifikace byla provedena podle retenčních parametrů, které byly předem stanoveny na standardních roztocích studovaných látek.
Složky kofetinových tablet se oddělí pomocí mobilní fáze acetonitril-voda-diethylamin (3:2,2:0,2). Retenční čas paracetamolu byl 3,08 minuty, propyfenazon - 5,73 minuty, kofein - 4,0 minuty, kodein - 4,67 minuty.
Složky saridonu lze také oddělit za použití mobilní fáze acetonitril-voda (8:2). Retenční čas pro paracetamol - 3,9 min, propyfenazon - 5,11 min, kofein - 4,44 min.
Pro kvantifikaci byla použita metoda absolutní kalibrace. Přímá úměrná závislost koncentrace látky na výšce píku byla pozorována pro paracetamol v rozmezí 50-200 μg / ml, pro propyfenazon - 25-128 μg / ml, kofein - 20-50 μg / ml, kodein - 59-234 μg / ml.
Metoda HPLC má určitá omezení při analýze komplexních směsí. Při současné přítomnosti látek ve směsi v makro- a mikromnožství dochází k přetížení kolony, které ovlivňuje kvalitu separace a tvar odcházejících píků. V kofetinu je obsah kodeinfosfátu ve vztahu k paracetamolu a propyfenazonu 21-25krát nižší, proto se doporučuje tekutá extrakce k oddělení kodeinu od zbytku složek tablety. Již dříve jsme zjistili, že paracetamol, propyfenazon a kofein jsou extrahovány jedinou extrakcí ethylacetátem z vodných roztoků při pH 2,0 v množství 87,43, 87,29 a 87,84 % a kodein zůstává zcela ve vodném roztoku a pro jeho extrakci a koncentraci je nutné použít chloroform při pH 9,0-10,0.
Metoda kvantitativního stanovení paracetamolu, propyfenazonu a kofeinu v tabletách saridonu a kofeinu 20 tablet se rozdrtí v hmoždíři na jemný homogenní prášek, zváží se asi 0,01 g (přesně zváženo) prášku z rozdrcených tablet a vloží se do do odměrné baňky o objemu 25 ml se přidá 10 ml acetonitrilu a důkladně se promíchá.
Obsah baňky byl doplněn po značku acetonitrilem, promíchán a přefiltrován. Roztok se vstřikuje do chromatografické kolony v objemu 3,0 μl. Obsah paracetamolu, propyfenazonu a kofeinu je stanoven metodou absolutní kalibrace. Výsledky stanovení jsou uvedeny v tabulkách 1 a 2, ze kterých je patrné, že získané údaje jsou v přípustných mezích obsahu dle normativní dokumentace (RD).
Metoda kvantitativního stanovení kodeinfosfátu v kofetinových tabletách. Asi 0,2 g rozdrcených tablet (přesně zváženo) se rozpustí ve 20 ml vody, dobře se promíchá, dokud nevznikne homogenní roztok, zfiltruje se přes filtr na jemné a velmi jemné usazeniny, filtr se promyje 10 ml přečištěné vody. Roztok se okyselí 10% kyselinou sírovou na pH 2,0. Třikrát se extrahuje 10 ml podíly ethylacetátu. Extrakty se vyhodí. K vodnému roztoku se přidá 25% roztok amoniaku do pH 9,0-10,0. Extrahuje se třikrát chloroformem po částech 10 ml. Spojené chloroformové extrakty se umístí do porcelánových misek a odpaří se při teplotě místnosti. Suché zbytky se rozpustí v acetonitrilu, převedou do odměrné baňky o objemu 25 ml a stejným rozpouštědlem se upraví po značku, 3 μl vzniklého roztoku se nastříknou do chromatografické kolony a za popsaných podmínek se stanoví kodein. Výsledky stanovení jsou uvedeny v tabulce.3.
Pro posouzení přesnosti navržených metod a kontrolu reprodukovatelnosti výsledků byly připraveny a studovány modelové směsi. Údaje o příkladu tablet saridonu jsou uvedeny v tabulce.4. Jak je vidět z tabulky 4, relativní chyba stanovení nepřesahuje ±1,19 % pro paracetamol, ±1,16 % pro propyfenazon a ±1,63 % pro kofein.
Metoda kvantitativního stanovení složek tablet saridonu v modelových směsích. Zváží se přesné hmotnosti paracetamolu (asi 0,08 g), propyfenazonu (asi 0,05 g) a kofeinu (asi 0,016 g), přemístí se do odměrné baňky o objemu 50 ml, rozpustí se v malém objemu acetonitrilu a stejným rozpouštědlem se upraví na značku . Odebere se 2,5 ml alikvot a přenese se do 25 ml odměrné baňky, objem se upraví po značku stejným rozpouštědlem, promíchá se a zfiltruje. Roztok se nastříkne do chromatografické kolony v objemu 3 ul.
závěry
1. Byla vyvinuta technika pro detekci složek kofetinových a saridonových tablet pomocí HPLC.
Retenční čas pro paracetamol byl 3,08 minuty, pro propyfenazon 5,73 minuty, kofein 4 minuty a kofein 4,67 minuty.
2. Pro kvantitativní stanovení složek tablet kofetinu a saridonu byla navržena metoda HPLC.
Relativní chyba stanovení byla ±1,19-1,21 % pro paracetamol, ±1,16-1,71 % pro propyfenazon, ±1,22-1,63 % pro kofein a ±2,95 % pro kodein.
3. Standardizace léku "Adanol"
Farmaceutická společnost "Polisan" vyvinula řadu komplexních metabolických léků, které stimulují metabolické procesy mozku, včetně "Cytoflavin" (injekce, tablety) a "Adanol". "Adanol" má výrazné antihypoxické a antiischemické vlastnosti a je slibný lék k léčbě pacientů s následky cévní mozkové příhody. Jedná se o tabletovou dávkovou formu potaženou enterosolventním potahem.
Obsahuje kyselinu jantarovou (YA), piracetam (Pc), riboxin (Rb), nikotinamid (NA), pyridoxin hydrochlorid (PG), riboflavinmononukleotid (RF).
Účelem práce je vyvinout metodu pro kvalitativní a kvantitativní stanovení UC v komplexních vícesložkových směsích na příkladu léku "Adanol".
Použili jsme vysokotlaký kapalinový chromatograf od Shimadzu (Japonsko) s UV detektorem a kolonu Hypersil BDS C18 od Supelco Inc. zrnitost 5 µm, délka 250 mm, vnitřní průměr 4,6 mm. Mobilní fáze je vodně organická fáze na bázi fosfátového pufru (pH 2,6-7,0). Detekční vlnová délka je 206 nm. Režim analýzy izokratický, rychlost eluce 500 µl/min; objem vzorku 20 µl. UV spektra byla zaznamenána na spektrofotometru Shimadzu UV mini-1240.
Pro kvantitativní stanovení většiny látek, které tvoří léčivo, byly navrženy spektrofotometrické metody analýzy. Porovnání spektrálních charakteristik složek přípravku však ukázalo, že absorpční oblasti YA, PG, NA, Pb a Pc v UV zóně se vzájemně překrývají (obr. 1).
V tomto ohledu nelze jejich obsah ve směsi stanovit přímou spektrofotometrií a v tomto případě je vhodné použít metodu HPLC. Pouze RF má specifickou absorpční oblast větší než 350 nm (lmax=373, E1% 1cm=202 a lmax=445 nm, E1% 1cm=243), proto je pro něj navržena kvalitativní a kvantitativní analýza spektrofotometrickou metodou. .
Na základě získaných dat byla pro analýzu 5 látek zvolena optimální pracovní vlnová délka, která je lopt = 206 nm (viz obr. 1). Tato hodnota je maximem UV spektra UC, které má nejnižší specifickou absorpci (lmax=206 nm E1% 1cm=5,8) ve srovnání s ostatními složkami směsi (viz tabulka).
Protože všechny látky obsažené v přípravku jsou ionogenní, je vhodné pro jejich analýzu použít chromatografii na reverzní fázi s nepolárními stacionárními a polárními mobilními fázemi. Při chromatografii iontových sloučenin na reverzní fázi je hodnota pH jedním z faktorů, který významně ovlivňuje účinnost separace jednotlivých látek. Při práci s moderními sorbenty s reverzní fází se jako součást mobilní fáze obvykle používají tlumivé roztoky pH od 2,0 do 8,0. Protože zvolená optimální pracovní vlnová délka je 206 nm, je nejlepší použít fosfátový pufr, protože nemá žádnou polohu v rozsahu vlnových délek UV nad 200 nm.
Aby bylo možné studovat chování YaC at různé hodnoty Jeho pH spektra byla měřena v roztocích fosfátového pufru pH 7,0 a 2,6 (obr. 2). Při pH 2,6 je pozorován hypochromní efekt molekulární formy UC - absorpce se sníží faktorem 3 ve srovnání se spektrem při pH 7,0 (při této hodnotě pH je disociace UC zcela potlačena). S ohledem na to je optimální hodnota pH mobilní fáze 7,0. Dále byl studován vliv složení a pH mobilní fáze na účinnost separace složek léčiva. Při pH 2,6 se směs úplně nerozdělila na jednotlivé píky - Pc, Na a PG se neoddělují a vycházejí jako první pík, následovaný YA a Pb ve formě jednotlivých píků. Při pH 5,5 také nedošlo k úplnému oddělení složek. Při pH 7,0 došlo k úplnému oddělení složek směsi. Všechny látky vyšly jako jednotlivé píky v následujícím pořadí: YA, Pc, PG, NA a Pb. Proces separace je však zdlouhavý – 45-50 minut.
Pro zajištění větší eluční schopnosti mobilní fáze a urychlení separačního procesu je nutné do jejího složení zavést méně polární organické rozpouštědlo. Z rozpouštědel nejčastěji používaných jako eluční činidla v HPLC jsme mohli použít acetonitril a methanol z hlediska limitu průhlednosti v UV světle při zvolené pracovní vlnové délce (lopt = 206 nm), jejichž limity průhlednosti jsou 195 a 205 nm.
Zavedení 2% methanolu do kompozice mobilní fáze zkrátilo dobu procesu, avšak pík HA měl vysokou asymetrii a pík Pb byl superponován na konec píku HA. Po snížení koncentrace methanolu na 1 % se píky Pb a HA nepřekrývaly, ale zvýšila se asymetrie píku HA. Pro jeho snížení byl do mobilní fáze obsahující 1 % methanolu zaveden acetonitril.
Jako výsledek experimentů byla vybrána mobilní fáze - vodně-organická fáze tvořená fosfátovým pufrem pH 7,0 obsahujícím 1 % methanolu a 0,5 % acetonitrilu, která zajistila efektivní separaci všech 5 složek (obr. 3). Celková doba chromatografie v tomto systému byla 35 minut a retenční časy složek byly přibližně (v minutách): 5,3 pro YaK, 15 pro Pc, 19,3 pro PG, 26 pro NA a 31 pro Pb.
Kvantitativní stanovení bylo provedeno metodou externího standardu s použitím roztoků standardních vzorků jednotlivých složek.
Metrologické charakteristiky navržené metody kvantitativního stanovení byly studovány na modelových směsích v 5 opakováních a jsou uvedeny v tabulce.
Jak vyplývá z tabulky, pomocí vyvinuté metody v přípravku "Adanol" je možné stanovit všech 5 složek s relativní chybou ne větší než 3 % s úroveň důvěry 95%.
Chromatogram získaný za výše uvedených podmínek odhalil kromě píků hlavních složek přípravku píky hypoxanthinu a kyseliny nikotinové přítomné ve výchozích látkách, jakož i píky vzniklé při hydrolýze z Pb a NA. Vyvinutá technika tedy umožňuje kvalitativně a kvantitativně stanovit tyto cizí nečistoty v přípravku.
závěry
1. Byly stanoveny optimální podmínky pro kvantitativní analýzu kyseliny jantarové metodou HPLC ve vícesložkové směsi.
2. Byla vyvinuta technika pro kvalitativní a kvantitativní analýzu složek léčiva "Adanol", včetně nečistot, s relativní chybou stanovení ne větší než 3%.
Seznam použité literatury
1. M.A. Kazmin, A.V. Michalev, A.P. Arzamastsev "Stanovení složek léčiva "BICILLIN-3" pomocí HPLC" // Lékárna - č. 5 - 2002 - str. 5-6.
2. T.Kh. Vergeichik, N.S. Onegov "HPLC v analýze přípravků obsahujících propyfenazon" // Lékárna - č. 6 - 2002 - str. 13-16.
3. A.Yu. Petrov, S.A. Dmitrichenko, A.L. Kovalenko, L.E. Alekseeva "Standardizace léku "Adanol" // Lékárna - č. 5 - 2002 - str.11-13.
Další
1. Baram G.I., Fedorová G.A. // Aplikace chromatografie v potravinářském, mikrobiologickém a lékařském průmyslu: Mat. Vses. Conf. - Gelendzhik, 1990 - S.43-44.
2. Krichkovskaya L.V., Chernenkaya L.A. // Aplikace chromatografie v potravinářském, mikrobiologickém a lékařském průmyslu: Mat. Vses. Conf. - Gelendzhik, 8.-12. října 1990, M., 1990. - S.49.
3. Chromatografie: Praktická aplikace metody: Ve 2 částech. 2. díl - M.: Mir, 1986. - 422 s.