Kiek chromatogramų reikia HPLC metodui įgyvendinti. Kursinis darbas: Natūralių ir nuotekų teršalų didelio efektyvumo skysčių chromatografija
„Aukšto efektyvumo skysčių chromatografija natūralių ir Nuotekos»
Įvadas
Skysčių chromatografijos metodų pagrindinės sąvokos ir klasifikacija
1.1 Skysčių chromatografijos aparatūra
2 skyrius. HPLC esmė
2.1 Taikymas
3 skyrius. HPLC panaudojimo objektų analizėje pavyzdžiai aplinką
4 skyrius HPLC prietaisai
Literatūra
Taikymas
Įvadas
Chromatografiniai metodai dažnai būtini nustatant ir kiekybiškai įvertinant organinės medžiagos su panašia struktūra. Įprastai aplinkos teršalų analizei plačiausiai naudojama dujų ir didelio efektyvumo skysčių chromatografija. Geriamųjų ir nuotekų organinių teršalų dujų chromatografinė analizė iš pradžių buvo pagrįsta supakuotų kolonėlių naudojimu, vėliau paplito ir kvarcinės kapiliarinės kolonėlės. Vidinis kapiliarinių kolonėlių skersmuo paprastai yra 0,20-0,75 mm, ilgis - 30-105 m. Optimalūs teršalų vandenyje analizės rezultatai dažniausiai pasiekiami naudojant skirtingo storio kapiliarines kolonėles iš metilfenilo silikonų, kuriuose yra fenilo. 5 ir 50 % grupės. Mėginių įpurškimo sistema dažnai tampa pažeidžiamu chromatografijos metodu, naudojant kapiliarines kolonėles. Mėginių įpurškimo sistemas galima suskirstyti į dvi grupes: universaliąsias ir selektyvines. Universalios yra įpurškimo sistemos su srauto padalijimu ir be jo, „šaltas“ įpurškimas į kolonėlę ir garinimas su temperatūros programavimu. Atrankinis įpurškimas naudoja valymą su tarpiniu gaudymu, viršutinės erdvės analize ir kt. Naudojant universalias įpurškimo sistemas, visas mėginys patenka į kolonėlę, su selektyviu įpurškimu įvedama tik tam tikra frakcija. Atrankinio įpurškimo rezultatai yra žymiai tikslesni, nes į kolonėlę patekusioje frakcijoje yra tik lakiųjų medžiagų, o technika gali būti visiškai automatizuota.
Dujų chromatografiniai detektoriai, naudojami teršalų monitoringe, dažnai skirstomi į universalius detektorius, kurie reaguoja į kiekvieną judriosios fazės komponentą, ir selektyvinius detektorius, reaguojančius į tam tikros grupės medžiagų buvimą judrioje fazėje su panašiomis medžiagomis. cheminės savybės. Universalūs yra liepsnos jonizacija, atominė emisija, masės spektrometriniai detektoriai ir infraraudonųjų spindulių spektrometrija. Vandens analizei naudojami selektyvūs detektoriai: elektronų gaudymo (selektyvus halogeno atomų turinčioms medžiagoms), terminis (selektyvus azoto ir fosforo turintiems junginiams), fotojonizacijos (selektyvus aromatiniams angliavandeniliams), elektrolitinio laidumo detektorius (selektyvus junginiams, turintiems halogeno). , sieros ir azoto atomai). Mažiausias aptinkamas medžiagų kiekis svyruoja nuo nanogramų iki pikogramų per sekundę.
Aukštos kokybės skysčių chromatografija(HPLC) yra idealus nustatymo metodas didelis skaičius termiškai nestabilūs junginiai, kurių negalima analizuoti naudojant dujų chromatografiją. Šiuo metu šiuolaikinės agrocheminės medžiagos, įskaitant metilo karbonatus ir organinius fosforo insekticidus bei kitas nelakias medžiagas, dažnai tampa skysčių chromatografijos analizės objektais. Didelio efektyvumo skysčių chromatografija (HPLC) populiarėja tarp kitų aplinkos stebėjimo metodų, taip pat todėl, kad ji turi puikių perspektyvų automatizuoti mėginių paruošimą.
1 SKYRIUS. PAGRINDINĖS SĄVOKOS IR SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS METODŲ KLASIFIKACIJA
Skysčių chromatografija skirstoma į kelias klases, priklausomai nuo stacionarios fazės atramos tipo. Dėl paprasto popieriaus ir plonasluoksnės chromatografijos prietaisų šie metodai buvo plačiai naudojami analitinėje praktikoje. Tačiau didelės kolonėlės skysčių chromatografijos galimybės paskatino šio klasikinio metodo įrangos tobulinimą ir leido greitai pradėti naudoti HPLC. Eliuento praleidimas per kolonėlę esant aukštam slėgiui leido smarkiai padidinti analizės greitį ir žymiai padidinti atskyrimo efektyvumą dėl smulkiai dispersinio sorbento naudojimo. Šiuo metu HPLC metodas leidžia išskirti, kiekybiškai ir kokybiškai išanalizuoti sudėtingus organinių junginių mišinius.
Pagal atskirtos medžiagos (eliuato) sąveikos su stacionaria faze mechanizmą išskiriama adsorbcija, pasiskirstymas, jonų mainai, dydžio išskyrimas, jonų poros, ligandų mainai ir afininė chromatografija.
Adsorbcinė chromatografija. Atskyrimas adsorbcinės chromatografijos būdu atliekamas atskiriamai medžiagai sąveikaujant su adsorbentu, pvz., aliuminio oksidu arba silikageliu, kurių paviršiuje yra aktyvūs poliniai centrai. Tirpiklis (eliuentas) yra nepolinis skystis. Sorbcijos mechanizmas susideda iš specifinės sąveikos tarp sorbento polinio paviršiaus ir analizuojamo komponento molekulių poliarinių (arba galinčių būti poliarizuotų) sričių (1 pav.).
Ryžiai. 1. Adsorbcinė skysčių chromatografija.
Pasiskirstymo chromatografija. Skysčių chromatografijos paskirstytoje versijoje medžiagų mišinio atskyrimas atliekamas dėl jų pasiskirstymo koeficientų skirtumo tarp dviejų nesimaišančių fazių - eliuento (judrios fazės) ir fazės, esančios ant sorbento (stacionari fazė).
At normalios fazės Skysčių chromatografijoje naudojamas nepolinis eliuentas ir polinės grupės, įskiepytos ant sorbento (dažniausiai silikagelio) paviršiaus. Pakeisti alkilchlorsilanai, turintys polinių grupių, tokių kaip nitrilas, aminogrupė ir kt., naudojami kaip silikagelio paviršiaus modifikatoriai (surištos fazės) (2 pav.). Surištų fazių naudojimas leidžia tiksliai kontroliuoti stacionarios fazės paviršiaus sorbcijos savybes ir pasiekti aukštą atskyrimo efektyvumą.
Ryžiai. 2. Pasiskirstymo chromatografija su surišta faze (normalios fazės variantas).
atvirkštinė fazė skysčių chromatografija pagrįsta mišinio komponentų pasiskirstymu tarp polinio eliuento ir nepolinių grupių (ilgų alkilo grandinių), įskiepytų ant sorbento paviršiaus (3 pav.).
Ryžiai. 3. Pasiskirstymo chromatografija su surišta faze (atvirkštinės fazės versija).
Mažiau plačiai naudojamas palaikomosios fazės skysčių chromatografijos variantas, kai skysta stacionari fazė uždedama ant stacionarios atramos.
Išskirtinis (skvarbi gelis) Chromatografija – tai skysčių chromatografijos variantas, kai medžiagos išsiskiria dėl molekulių pasiskirstymo tarp sorbento porose esančio tirpiklio ir tarp jo dalelių tekančio tirpiklio.
afininis Chromatografija pagrįsta specifine atskirtų baltymų (antikūnų) sąveika su medžiagomis (antigenais), įskiepytomis ant sorbento (sintetinės dervos) paviršiaus, kurie selektyviai sudaro kompleksus (konjugatus) su baltymais.
Jonų mainų, jonų porų, ligandų mainų chromatografija daugiausia naudojama neorganinėje analizėje.
Pagrindiniai chromatografinio atskyrimo parametrai.
Pagrindiniai chromatografinio atskyrimo parametrai yra sulaikymo tūris ir mišinio komponento sulaikymo laikas (4 pav.).
Sulaikymo laikas tR yra laikas, praėjęs nuo mėginio įšvirkštimo į kolonėlę iki atitinkamos smailės maksimumo. Sulaikymo laiką padauginę iš eliuento tūrio greičio F, gauname sulaikymo tūrį VR:
Pataisyta sulaikymo trukmė yra laikas, praėjęs nuo to momento, kai atsiranda nesorbuojamo komponento smailė iki atitinkamo junginio smailės:
tR" = tR - t0 ;
Normalizuotas arba pakoreguotas sulaikymo tūris yra sulaikymo tūris, pakoreguotas pagal kolonėlės negyvąjį tūrį V0, t. y. nesorbuojamo komponento sulaikymo tūris:
VR“ = VR – V0;
Sulaikymo charakteristika taip pat yra talpos koeficientas k", apibrėžiamas kaip nejudančioje fazėje esančios medžiagos masės ir judriosios fazės medžiagos masės santykis: k" = mn / mp;
K" reikšmę lengva nustatyti iš chromatogramos:
Svarbiausi chromatografinio atskyrimo parametrai yra jo efektyvumas ir selektyvumas.
Kolonėlės efektyvumas, matuojamas pagal teorinių plokštelių aukštį (HETP) ir atvirkščiai proporcingas jų skaičiui (N), yra didesnis, tuo siauresnė medžiagos smailė, atsirandanti tuo pačiu sulaikymo laiku. Efektyvumo vertę galima apskaičiuoti pagal chromatogramą, naudojant šią formulę:
N = 5,54. (tR / 1/2) 2,
kur tR- laikymo laikas,
w 1/2 - smailės plotis per pusę aukščio
Žinant teorinių plokštelių skaičių kolonėlėje, kolonėlės ilgį L ir vidutinį sorbento grūdelių skersmenį dc, nesunku gauti teorinio plokštelės ekvivalentinio aukščio (HETP) ir sumažinto aukščio (PETP) reikšmes:
HETP = L/N PHETP = HETP/d c
Šios charakteristikos leidžia palyginti skirtingų tipų kolonų efektyvumą, įvertinti sorbento kokybę ir kolonų užpildymo kokybę.
Dviejų medžiagų atskyrimo selektyvumas nustatomas pagal lygtį:
Svarstant dviejų komponentų mišinio atskyrimą, atskyrimo laipsnis RS taip pat yra svarbus parametras:
;
Smailės laikomos išspręstomis, jei RS reikšmė yra didesnė arba lygi 1,5.
Pagrindiniai chromatografiniai parametrai yra susiję su šia skiriamąja geba:
;
Atskyrimo selektyvumą lemia šie veiksniai:
1) sorbento cheminė prigimtis;
2) tirpiklio ir jo modifikatorių sudėtis;
3) atskiriamo mišinio komponentų cheminė struktūra ir savybės;
4) kolonėlės temperatūra
1.1 Skysčių chromatografijos aparatūra
Šiuolaikinėje skysčių chromatografijoje naudojami įvairaus sudėtingumo instrumentai – nuo paprasčiausių sistemų iki aukščiausios klasės chromatografų su įvairiais papildomais įrenginiais.
Ant pav. 4 paveiksle parodyta blokinė skysčių chromatografo schema, kurioje yra minimalus reikiamas komponentų rinkinys viena ar kita forma, esantis bet kurioje chromatografinėje sistemoje.
Ryžiai. 4. Skysčių chromatografo blokinė schema.
Siurblys (2) sukurtas nuolatiniam tirpiklio srautui sukurti. Jo konstrukciją pirmiausia lemia darbinis slėgis sistemoje. Darbui 10-500 MPa diapazone naudojami stūmokliniai (švirkštiniai) arba stūmokliniai siurbliai. Pirmojo trūkumas yra tai, kad reikia periodiškai sustabdyti užpildymą eliuentu, o antrasis - didelis dizaino sudėtingumas ir dėl to didelė kaina. Paprastoms sistemoms su žemu 1-5 MPa darbiniu slėgiu sėkmingai naudojami nebrangūs peristaltiniai siurbliai, tačiau kadangi sunku pasiekti pastovų slėgį ir srauto greitį, jų naudojimas apsiriboja paruošiamaisiais darbais.
Injektorius (3) užtikrina, kad atskirtų komponentų mišinio mėginys būtų įpurškiamas į kolonėlę pakankamai dideliu atkuriamumu. Paprastoms „stop-flow“ mėginių įpurškimo sistemoms reikia sustabdyti siurblį, todėl jos yra mažiau patogios nei „Reodyne“ kilpinės pipetės.
HPLC kolonėlės (4) yra storasieniai nerūdijančio plieno vamzdžiai, galintys atlaikyti aukštą slėgį. Svarbų vaidmenį atlieka kolonėlės užpildymo sorbentu tankis ir vienodumas. Žemo slėgio skysčių chromatografijai sėkmingai naudojamos storasienės stiklinės kolonėlės. Temperatūros pastovumą užtikrina termostatas (5).
Skysčių chromatografijos detektoriai (6) turi srauto kamerą, kurioje nuolat matuojama tam tikra tekančio eliuento savybė. Populiariausi bendrosios paskirties detektorių tipai yra refraktometrai, matuojantys lūžio rodiklį, ir spektrofotometriniai detektoriai, matuojantys tirpiklio absorbciją esant fiksuotam bangos ilgiui (dažniausiai ultravioletinėje srityje). Refraktometrų pranašumai (ir spektrofotometrų trūkumai) yra mažas jautrumas nustatomo junginio tipui, kuriame gali nebūti chromoforų grupių. Kita vertus, refraktometrų naudojimas apsiriboja izokratinėmis sistemomis (su pastovia eliuento sudėtimi), todėl šiuo atveju negalima naudoti tirpiklio gradiento.
HPLC kolonėlės, kurios dažniausiai naudojamos aplinkos teršalų analizei, yra 25 cm ilgio ir 4,6 mm vidinio skersmens, užpildytos 5-10 µm sferinėmis silikagelio dalelėmis, įskiepytomis oktadecilo grupėmis. AT pastaraisiais metais atsirado mažesnio vidinio skersmens kolonos, užpildytos smulkesnėmis dalelėmis. Tokių kolonėlių naudojimas sumažina tirpiklių sąnaudas ir analizės trukmę, padidina jautrumą ir atskyrimo efektyvumą, taip pat palengvina kolonėlių prijungimo prie spektrinių detektorių problemą. Kolonėlės, kurių vidinis skersmuo yra 3,1 mm, turi saugos kasetę (prieškolonėlę), kuri padidina tarnavimo laiką ir pagerina analizių atkuriamumą.
Kaip detektoriai šiuolaikiniuose HPLC prietaisuose dažniausiai naudojamas UV detektorius ant diodų matricos, fluorescencijos ir elektrocheminiai detektoriai.
Reikėtų nepamiršti, kad praktiniame darbe atskyrimas dažnai vyksta ne vienu, o keliais mechanizmais vienu metu. Taigi išskyrimą gali apsunkinti adsorbcijos efektai, adsorbcijos – pasiskirstymas ir atvirkščiai. Šiuo atveju, kuo didesnis mėginyje esančių medžiagų skirtumas pagal jonizacijos laipsnį, šarmiškumą ar rūgštingumą, pagal molekulinę masę, poliarizaciją ir kitus parametrus, tuo didesnė tokių medžiagų atskyrimo mechanizmo kitokio tikimybė. .
Praktikoje labiausiai paplito „atvirkštinės fazės“ (padalinio) chromatografija, kai nejudanti fazė yra ne polinė, o judrioji fazė (t. y. atvirkštinė „tiesios fazės“ chromatografija).
Daugumoje pasaulio laboratorijų 16 prioritetinių PAH yra analizuojama HPLC arba CMS.
2 SKYRIUS. HPLC ESMĖ
Taikant didelio efektyvumo skysčių chromatografiją (HPLC), chromatografinėje kolonėlėje vykstančių procesų pobūdis paprastai yra identiškas dujų chromatografijos procesams. Skirtumas yra tik naudojant skystį kaip stacionarią fazę. Dėl didelio skystųjų judriųjų fazių tankio ir didelio kolonėlių atsparumo dujų ir skysčių chromatografijos prietaisai labai skiriasi.
HPLC kaip judriosios fazės dažniausiai naudojami gryni tirpikliai arba jų mišiniai.
Norint sukurti gryno tirpiklio (arba tirpiklių mišinių), vadinamo eliuentu skysčių chromatografijoje, srautą, naudojami siurbliai, kurie yra chromatografo hidraulinės sistemos dalis.
Adsorbcinė chromatografija atliekama medžiagai sąveikaujant su adsorbentais, tokiais kaip silikagelis arba aliuminio oksidas, kurių paviršiuje yra aktyvūs centrai. Skirtingas gebėjimas sąveikauti su skirtingų mėginių molekulių adsorbcijos centrais lemia jų atskyrimą į zonas judant su mobiliąja faze per kolonėlę. Šiuo atveju pasiekiamas komponentų zonų padalijimas priklauso nuo sąveikos tiek su tirpikliu, tiek su adsorbentu.
Skirtingo tūrio, paviršiaus ir porų skersmens silikagelio adsorbentai yra labiausiai pritaikyti HPLC. Aliuminio oksidas ir kiti adsorbentai naudojami daug rečiau. Pagrindinė to priežastis:
Nepakankamas mechaninis stiprumas, dėl kurio negalima pakuoti ir naudoti esant aukštam slėgiui, būdingam HPLC;
silikagelis, palyginti su aliuminio oksidu, turi platesnį poringumo, paviršiaus ir porų skersmens diapazoną; žymiai didesnis aliuminio oksido katalizinis aktyvumas lemia analizės rezultatų iškraipymą dėl mėginio komponentų irimo arba jų negrįžtamos chemisorbcijos.
HPLC detektoriai
Didelio efektyvumo skysčių chromatografija (HPLC) naudojama polinėms nelakiosioms medžiagoms aptikti, kurios dėl kokių nors priežasčių negali būti paverstos tinkama dujų chromatografijai, net ir darinių pavidalu. Tokios medžiagos visų pirma apima sulfonrūgštis, vandenyje tirpius dažus ir kai kuriuos pesticidus, tokius kaip fenilkarbamido dariniai.
Detektoriai:
UV - diodų matricos detektorius. Fotodiodų „matrica“ (jų yra daugiau nei du šimtai) nuolat registruoja signalus UV ir matomoje spektro srityje, taip užtikrindama UV-B spektrų fiksavimą skenavimo režimu. Tai leidžia nuolat, esant dideliam jautrumui, įrašyti neiškraipytus komponentų, greitai praeinančių per specialią ląstelę, spektrus.
Palyginti su vieno bangos ilgio aptikimu, kuris nesuteikia informacijos apie smailės „grynumą“, galimybė palyginti visus diodų matricos spektrus suteikia identifikavimo rezultatą su daug didesniu tikrumo laipsniu.
Fluorescencinis detektorius. Didžiulį fluorescencinių detektorių populiarumą lemia labai didelis selektyvumas ir jautrumas bei tai, kad daugelis aplinkos teršalų fluorescuoja (pavyzdžiui, poliaromatiniai angliavandeniliai).
Elektrocheminis detektorius naudojamas lengvai oksiduojamoms arba redukuojančioms medžiagoms aptikti: fenolius, merkaptanus, aminus, aromatinius nitro ir halogenų darinius, aldehidus, ketonus, benzidinus.
Chromatografinis mišinio atskyrimas ant kolonėlės dėl lėto PF judėjimo užtrunka ilgai. Siekiant pagreitinti procesą, chromatografija atliekama esant slėgiui. Šis metodas vadinamas didelio efektyvumo skysčių chromatografija (HPLC).
Modernizavus klasikinėje skysčių kolonėlės chromatografijoje naudojamą įrangą, ji tapo vienu iš perspektyvių ir modernių analizės metodų. Didelio efektyvumo skysčių chromatografija yra patogus nelakiųjų mažos ir didelės molekulinės masės termolabiųjų junginių atskyrimo, preparatinio išskyrimo ir kokybinės bei kiekybinės analizės metodas.
Priklausomai nuo šiuo metodu naudojamo sorbento tipo, naudojami 2 chromatografijos variantai: ant polinio sorbento naudojant nepolinį eliuentą (tiesioginės fazės parinktis) ir ant nepolinio sorbento naudojant polinį eliuentą – taip vadinamą atvirkštinį. -fazinė didelio efektyvumo skysčių chromatografija (RPHLC).
Kai eliuentas pereina į eliuentą, pusiausvyra RPHLC sąlygomis nusistovi daug kartų greičiau nei polinių sorbentų ir nevandeninių PF sąlygomis. Dėl to, taip pat dėl patogumo dirbti su vandeniu ir vandens-alkoholio eliuentais, RPHLC dabar įgijo didelį populiarumą. Dauguma HPLC analizių atliekamos naudojant šį metodą.
Detektoriai. Atskiro komponento stulpelio išvesties registracija atliekama naudojant detektorių. Registruodami galite naudoti bet kurio analitinio signalo, gaunamo iš judriosios fazės, pasikeitimą, susijusį su mišinio komponento pobūdžiu ir kiekiu. Skysčių chromatografijoje naudojami tokie analitiniai signalai kaip išeinančio tirpalo šviesos sugertis arba šviesos emisija (fotometriniai ir fluorimetriniai detektoriai), lūžio rodiklis (refraktometriniai detektoriai), potencialas ir elektrinis laidumas (elektrocheminiai detektoriai) ir kt.
Nuolat aptinkamas signalas įrašomas diktofono. Chromatograma yra detektoriaus signalų, įrašytų įrašymo juostoje, seka, generuojama, kai atskiri mišinio komponentai išeina iš kolonėlės. Mišinio atskyrimo atveju išorinėje chromatogramoje matomos atskiros smailės. Smailės padėtis chromatogramoje naudojama medžiagai identifikuoti, smailės aukštis arba plotas – kiekybiniam nustatymui.
2.1 Taikymas
HPLC randa plačiausią pritaikymą šiose cheminės analizės srityse (nustatyti analizės objektai, kuriuose HPLC praktiškai nekonkuruoja):
· Maisto kokybės kontrolė – tonizuojantys ir skonio priedai, aldehidai, ketonai, vitaminai, cukrūs, dažikliai, konservantai, hormonai, antibiotikai, triazinas, karbamatas ir kiti pesticidai, mikotoksinai, nitrozoaminai, policikliniai aromatiniai angliavandeniliai ir kt.
· Aplinkos apsauga – fenoliai, organiniai nitro junginiai, mono- ir policikliniai aromatiniai angliavandeniliai, nemažai pesticidų, pagrindiniai anijonai ir katijonai.
· Kriminalistika – narkotikai, organiniai sprogmenys ir dažikliai, stiprūs vaistai.
· Farmacijos pramonė – steroidiniai hormonai, praktiškai visi organinės sintezės produktai, antibiotikai, polimerų preparatai, vitaminai, baltyminiai preparatai.
Medicina – išvardytos biocheminės ir vaistinės medžiagos bei jų metabolitai biologiniuose skysčiuose (aminorūgštys, purinai ir pirimidinai, steroidiniai hormonai, lipidai) diagnozuojant ligas, nustatant vaistų pasišalinimo iš organizmo greitį, atsižvelgiant į jų individualų dozavimą. .
· Žemdirbystė- nitratų ir fosfatų nustatymas dirvose, siekiant nustatyti reikiamą tręštų trąšų kiekį, pašarų maistinės vertės (amino rūgščių ir vitaminų) nustatymas, pesticidų dirvožemyje, vandenyje ir žemės ūkio produktuose analizė.
Biochemija, bioorganinė chemija, genų inžinerija, biotechnologijos – cukrūs, lipidai, steroidai, baltymai, aminorūgštys, nukleozidai ir jų dariniai, vitaminai, peptidai, oligonukleotidai, porfirinai ir kt.
· Organinė chemija – visi stabilūs organinės sintezės produktai, dažikliai, termolabilūs junginiai, nelakūs junginiai; neorganinė chemija (praktiškai visi tirpūs junginiai jonų ir kompleksinių junginių pavidalu).
· Maisto produktų, alkoholinių ir nealkoholinių gėrimų, geriamojo vandens, buitinės chemijos, kvepalų kokybės kontrolė ir sauga visuose jų gamybos etapuose;
taršos pobūdžio nustatymas žmogaus sukeltos nelaimės ar ekstremalios situacijos vietoje;
aptikti ir analizuoti narkotines, stipriai veikiančias, nuodingas ir sprogmenų;
buvimo nustatymas kenksmingų medžiagų(policikliniai ir kiti aromatiniai angliavandeniliai, fenoliai, pesticidai, organiniai dažikliai, sunkieji, šarminių ir šarminių žemių metalų jonai) įmonių ir gyvų organizmų nuotekose, išmetamuose į orą ir kietosiose atliekose;
· organinės sintezės, naftos ir anglies perdirbimo, biocheminės ir mikrobiologinės produkcijos procesų stebėjimas;
tręšimo dirvožemio kokybės, pesticidų ir herbicidų buvimo dirvožemyje, vandenyje ir produktuose bei pašarų maistinės vertės analizė; sudėtingos tyrimo analitinės užduotys; gauti mikro kiekį itin grynos medžiagos.
3 SKYRIUS. HPLC NAUDOJIMO APLINKOS OBJEKTŲ ANALIZĖS PAVYZDŽIAI
HPLC – PAH stebėjimo metodas aplinkos objektuose
Policikliniams aromatiniams angliavandeniliams (PAH), I pavojingumo klasės ekotoksinėms medžiagoms, buvo nustatytos itin žemos didžiausios leistinos koncentracijos (MAC). gamtos objektai. PAH nustatymas MPC lygiu ir žemiau yra viena iš labai sudėtingų analitinių užduočių ir joms spręsti naudojami aukštųjų technologijų analizės metodai (GC-MS, GC, HPLC). Renkantis stebėjimo metodą, be pagrindinių nagrinėjamų savybių - jautrumo ir selektyvumo, pridedamas išraiškingumas ir ekonomiškumas, nes. stebėjimas apima serijinę analizę. HPLC variantas ant trumpų mažo skersmens kolonėlių didžiąja dalimi atitinka nurodytus reikalavimus. Naudodami šį metodą, autoriai sukūrė ir sertifikavo benzo[a]pireno stebėjimo metodus trijose natūraliose terpėse: aerozolyje, sniego dangoje ir paviršiniuose vandenyse. Metodams būdingas: paprastas vieningas mėginio paruošimas, įskaitant PAH ekstrahavimą organiniais tirpikliais ir ekstrakto koncentravimą, tiesioginį koncentruoto ekstrakto įvedimą į chromatografinę kolonėlę, daugiabangio fotometrinio aptikimo panaudojimą UV spektro srityje, identifikavimą. PAH smailių chromatogramose, naudojant du parametrus – sulaikymo laiką ir spektrinį santykį. Bendra paklaida neviršija 10%, kai nustatomas benz[a]pirenas aerozolyje, kai koncentracija yra nuo 0,3 iki 450 ng/m iki 50 μg/m2. Tuo pačiu metu nustatant prioritetinius PAH (iki 12 junginių) ir registruojant nehomogenines analičių smailes, buvo pasiūlyta ekstraktą atskirti iš naujo, keičiant judriosios fazės selektyvumą, aptikimo bangos ilgį ir kolonėlės temperatūrą, atsižvelgiant į individualias nustatomų PAH savybes.
1 . Aplinkos oro kokybė. Benzo[a]pireno masės koncentracija. Matavimų HPLC metodu atlikimo procedūra. 01-2000 MVI atestacijos pažymėjimas Nr.
2 . Paviršinių ir išvalytų nuotekų kokybė. Benzo[a]pireno masės koncentracija. Matavimų HPLC metodu atlikimo procedūra. 01-2001 MVI atestacijos pažymėjimas Nr.
3 . Sniego dangos kokybė. Benzo[a]pireno masės koncentracija. Matavimų HPLC metodu atlikimo procedūra. 2001-02 MVI atestacijos pažymėjimas Nr.
Anilino pašalinimas iš vandeninių tirpalų, naudojant valcuoto vario apnašų aliuminio terminio regeneravimo atliekas
Angliavandenilių pašalinimo iš nuotekų problema yra neatidėliotina užduotis. Daugelyje chemijos, naftos chemijos ir kitų pramonės šakų susidaro anilinas ir jo dariniai, kurie yra toksiškos medžiagos. Anilinas yra labai toksiška medžiaga, MPC - 0,1 mg / m 3. Anilinas ir jo dariniai tirpsta vandenyje, todėl jų negalima pašalinti gravitaciniu nusėdimu.
Vienas geriausių nuotekų valymo nuo organinių teršalų būdų yra regeneruoti galinčių neorganinių ir organinių adsorbentų (aliumosilikatai, modifikuotas molis, mediena, pluoštas ir kt.) ir negalinčių atsinaujinti (aktyvuota anglis, makroporingos polimerinės medžiagos ir kt.) naudojimas. . ).
Regeneruoti adsorbentai gali pašalinti iš vandens skirtingo poliškumo organines medžiagas. Veiksmingų adsorbentų paieška yra neatidėliotina užduotis.
Šioje ataskaitoje pateikiami Jerevano kabelių gamyklos (OPMOERKZ) frezuoto vario skalės naudojimo kaip anilino sorbentų tyrimo rezultatai.
Chromatografiniai tyrimai buvo atlikti naudojant HPLC chromatografą / didelio efektyvumo skysčių chromatografiją / sistemas (Waters 486 - detektorius, Waters 600S - valdiklis, Waters 626 - siurblys), 250 x 4 mm kolonėlėje, užpildytoje tiriamais sorbentais, judriosios fazės greitis 1 ml/m / judri fazė yra tirpikliai, kuriuos tiriame/, detektorius yra UV-254. UV spektroskopinė analizė atlikta spektrofotometru Specord-50, spektrai gauti naudojant ASPECT PLUS kompiuterinę programą.
Tiksliai pasvertos sorbentų porcijos buvo dedamos į tam tikrą anilino kiekį vandenyje, kurio pradinės koncentracijos svyravo. Mišinys kruopščiai kratomas 6 val., tada mėginys paliekamas nusistovėti. Adsorbcija baigiasi per beveik 48 val.. Nusodinto anilino kiekis nustatytas UV spektrofotometrine ir refrakcijos analize.
Iš pradžių buvo tiriamos OPMOEPKZ adsorbcijos savybės pašalinant anilą iš anglies tetrachlorido tirpalo. Paaiškėjo, kad anilinas geriausiai sugeria sorbentą 3 (lentelė).
Taip pat buvo atlikti 0,01-0,0001 mol/l koncentracijos anilino vandeninių tirpalų matavimai. Lentelėje pateikti duomenys apie 0,01 M tirpalą.
Anilino absorbcija įvairiais sorbentais iš 0,01 M vandeninio anilino tirpalo 20°C temperatūroje
Anksčiau buvo nustatyta, kad adsorbcija nurodytuose koncentracijos intervaluose didėja ir priklauso tiesiškai nuo lūžio rodiklio. Anilino kiekis buvo nustatytas iš lūžio rodiklio ir molinės koncentracijos diagramos ir pakoreguotas tiek skysčių chromatografijai, tiek UV spektrinei analizei.
Vandeniniams tirpalams aktyviausias yra sorbentas 3. Adsorbuoto teršalo kiekis buvo skaičiuojamas kaip skirtumas tarp bendro teršalo kiekio, pridėto į pradinį tirpalą ir jo likučių galutiniame tirpale.
PAH aplinkos objektuose nustatymo metodai
Paprastai PAH nustatyti naudojami dujų chromatografijos (GC) ir didelio efektyvumo skysčių chromatografijos (HPLC) metodai. pagrindinių 16 PAH atskyrimas, pakankamas kiekybinei analizei, pasiekiamas naudojant kapiliarines kolonėles dujų chromatografijoje arba didelio efektyvumo kolonėles, naudojamas HPLC. Reikia atsiminti, kad kolonėlė, kuri gerai atskiria šešiolikos PAH kalibracinius mišinius, negarantuoja, kad jie bus gerai atskirti ir kartu su tiriamų mėginių organiniais junginiais.
Siekiant supaprastinti analizę, taip pat pasiekti Aukštos kokybės Gauti rezultatai, dauguma analitinių procedūrų apima išankstinio PAH išskyrimo (atskyrimo) etapą nuo kitų giminingų junginių grupių mėginiuose. Dažniausiai šiam tikslui taikomi metodai yra žemo slėgio skysčių chromatografija skystis-kieta arba skystis-skystis sistemose naudojant adsorbcijos mechanizmus, pavyzdžiui, naudojant silikagelį arba aliuminio oksidą, kartais naudojami mišrūs mechanizmai, pavyzdžiui, adsorbcija ir išskyrimas naudojant Sephadex. .
Išankstinio mėginių apdorojimo naudojimas leidžia išvengti:
Visiškai nepoliniai junginiai, tokie kaip alifatiniai angliavandeniliai;
Vidutiniškai ir stipriai poliniai junginiai, pavyzdžiui, ftalanas, fenoliai, daugiahidroksiliai alkoholiai, rūgštys;
Didelės molekulinės masės junginiai, tokie kaip, pavyzdžiui, dervos.
Didelio efektyvumo skysčių chromatografijoje (HPLC) daugiausia naudojami dviejų tipų detektoriai: fluorimetrinis detektorius arba fotodiodo juostos spektrofotometrinis detektorius. PAH aptikimo riba fluorimetrinio aptikimo metu yra labai žema, todėl šis metodas ypač tinkamas poliaromatinių junginių pėdsakams nustatyti. Tačiau klasikiniai fluorimetriniai detektoriai praktiškai nesuteikia informacijos apie tiriamo junginio struktūrą. Šiuolaikinės konstrukcijos leidžia įrašyti fluorescencijos spektrus, būdingus atskiriems junginiams, tačiau jie dar nėra plačiai paplitę atliekant įprastinius matavimus. Spektrofotometrinis detektorius su fotodiodo linija (PDL) leidžia įrašyti absorbcijos spektrus UV ir matomajame spektro diapazone, šie spektrai gali būti naudojami identifikavimui. Panašią informaciją galima gauti naudojant greito nuskaitymo detektorius.
Renkantis analizės metodą šių PAH atskyrimui, identifikavimui ir kiekybiniam įvertinimui, reikia atsižvelgti į šias sąlygas:
Tiriamuose mėginiuose nustatyto kiekio lygis;
susijusių medžiagų skaičius;
Taikoma analitinė procedūra (matavimo procedūra);
Serijinės įrangos galimybės.
Šarminių žemių elementų ir magnio nustatymo jonų didelio efektyvumo skysčių chromatografijos metodo sukūrimas
Metodų, leidžiančių spręsti vandens analizės problemas, kūrimas ir tobulinimas yra svarbi analitinės chemijos problema. Didelio efektyvumo skysčių chromatografijos kūrimas aukštas spaudimas paskatino naujos jonų mainų chromatografijos krypties – vadinamosios jonų chromatografijos – kūrimą. Jonų chromatografijos sorbentų sintezė yra sudėtinga, nes jiems keliami gana dideli reikalavimai. Kadangi rinkoje trūko didelio našumo katijonų keitiklių, buvo naudojama dinamiškai modifikuota atvirkštinė fazė, kuriai buvo susintetintas modifikatorius: N-heksadecil-N-dekanoil-para-amino-benoilsulfonrūgšties etil-diizopropilamonis (DGDASC), kur hidrofobinis aminas, turintis SO3 grupę, galintis keistis katijonais. Praleidus modifikatoriaus tirpalą, absorbcija esant l = 260 nm pasiekė 6,4 optinio tankio vienetų (° E), pasiekdama plokščiakalnį. Apskaičiuota jonų mainų talpa yra 15,65 µmol. Kadangi šarminių žemių elementų ir magnio katijonai neabsorbuoja UV spektro srityje, buvo naudojamas netiesioginis UV aptikimas naudojant susintetintą UV sugeriantį eliuentą 1,4-dipiridinio butano bromidą (DPB bromidą). Kadangi halogeno jonai ardo plienines kolonėlės dalis, 1,4-dipiridinio butano bromido jonas buvo pakeistas acetato jonu. Kol kolonėlė plaunama eliuentu, modifikatoriaus etildiizopropilamonio priešjonas pakeičiamas UV spindulius sugeriančiu jonu 1,4-dipiridiniumbutanu. Katijonų atskyrimas atliktas esant optimaliam bangos ilgiui l = 260 nm 0,4 A skalėje „skalės lankstymo“ režimu; magnetofono poliškumas buvo pakeistas. Visų tirtų katijonų atskyrimas pasiektas įvedus kompleksuojančią priedą – oksalo rūgštį. Mg 2+, Ca 2+, Sr 2+, Ba 2+ aptikimo ribos yra 8 μg/l; 16 µg/l; 34 µg/l; atitinkamai 72 µg/l. Pasirinktomis sąlygomis buvo tiriamas vandentiekio vanduo, kuriame Ca 2+ yra 10,6 +1,9 mg-jonų/l, Mg 2+ -2,5 + mg-jonų/l. Atkuriamumo paklaida neviršija -2,2% Ca 2+ ir 1,4% Mg 2+.
Kadmio kompleksų aplinkoje analizė
Norint ištirti sunkiųjų metalų migracijos biosferoje mechanizmus, reikalingi duomenys apie metalų egzistavimo gamtoje chemines formas. Sunkumai analizuojant junginius iš labiausiai toksiški metalai- kadmis - dėl to, kad jis sudaro nestabilius kompleksus, o bandant juos izoliuoti, iškreipiama natūrali pusiausvyra. Šiame darbe kadmio junginiai dirvožemyje ir augaluose buvo tiriami naudojant metodą, pagrįstą chromatografiniu ekstraktų atskyrimu, o po to komponentų identifikavimu atliekant cheminę analizę. Šis metodas leido ne tik nustatyti chemines kadmio formas, bet ir atsekti jų transformacijas aplinkos objektuose.
Biosferos objektuose su kadmiu derinamos angliavandenių ir polifenolių OH grupės (įskaitant flavonoidus), C=O, fosfatai, NH 2, NO 2, SH grupės. Šio tyrimo tikslais buvo sudarytas modelių ligandų rinkinys, atstovaujantis šioms junginių klasėms. Modelinių ligandų sąveika su vandenyje tirpiomis kadmio druskomis buvo tiriama UV spektroskopija ir HPLC.
Kadmio junginiams išskirti taikytas ekstrahavimas specialiai parinktais (su Cd kompleksų nesudarant) tirpikliais. Tokiu būdu kadmis gali būti atskirtas nuo visų sunkiųjų metalų, išskyrus jam artimą cheminį analogą – cinką. Kadmio ir cinko turinčios smailės gautų ekstraktų chromatogramose buvo aptiktos surišant metalus jų ditizonatų pavidalu. Norint atskirti nuo cinko, buvo naudojamas Cd ir Zn kompleksų stabilumo skirtumas esant pH 6–8. Išskirti Cd junginiai buvo identifikuoti HPLC, kai eliuavimo metu pakito pH. Atlikta kadmio junginių su dirvožemio komponentais ir augalų audiniais analizė, nustatytos medžiagos, kurias gamina augalai, reaguodami į padidėjusį kadmio pasisavinimą iš dirvožemio. Įrodyta, kad flavonoidai, ypač tricinas, yra apsauginės medžiagos grūduose, cisteino alkoksi dariniai ankštiniuose augaluose ir polifenoliai bei tioliai kryžmažiedžiuose augaluose.
4 SKYRIUS. HPLC ĮRANGA
SERIJA ACCELA
Naujasis ACCELA ypač didelio našumo skysčių chromatografas gali veikti plačiausiu srauto ir slėgių diapazonu, užtikrindamas tipišką HPLC atskyrimą įprastose kolonėlėse ir ypač greitą bei efektyvų atskyrimą kolonėlėse, kurių sorbento dalelių dydis yra mažesnis nei 2 µm. itin aukštas slėgis (didesnis nei 1000 atm.).
Sistema apima ketvirtinio gradiento inertinį siurblį, galintį tiekti didesnį nei 1000 atm slėgį ir tik 65 µl uždelsimo tūrį, užtikrinantį greitą chromatografinį atskyrimą. Automatinis mėginių ėmiklis ACCELA gali veikti per 30 sekundžių mėginio įpurškimo ciklą ir užtikrina didžiausią įpurškimo atkartojamumą. Diodų matricos detektorius Accela PDA su minimaliu srauto kameros tūriu (2 µl) yra optimizuotas didelės spartos chromatografijai, naudoja patentuotą LightPipe technologiją ir išlaiko simetrišką smailės formą, kuri pateikiama su nepriekaištinga chromatografijos sistema ir kolonėlėmis.
Sistema puikiai dera su masės spektrometrais, kad sukurtų galingiausias ir geriausias LC/MS sistemas pasaulyje.
„Thermo Electron“ siūlo 1,9 µm UHP kolonėles visoms reikmėms
SERIJA TSP
Modulinis HPLC prietaisų konstrukcijos principas leidžia klientui lanksčiai komplektuoti įrangą, sprendžiančią bet kokias analitines problemas, o joms pasikeitus, ją galima greitai ir ekonomiškai modifikuoti. Platus modulių asortimentas apima siurblius nuo izokratinio iki ketvirtinio gradiento, nuo mikrokolonėlių iki pusiau paruošiamųjų, visus turimus detektorius, mėginių įpurškimo sistemas nuo rankinių injektorių iki automatinių mėginių ėmimo įrenginių su galimybe apdoroti bet kokį mėginį, galingą programinę įrangą matavimo rezultatams apdoroti ir valdyti visus modulius. sistemos. Visi moduliai yra sertifikuoti CSA, TUF/GS, FCC(EMI), VDE (EMI), ISO-9000, yra kompaktiški, modernaus dizaino, lengvai valdomi, su įmontuotu ekranu ir savidiagnostika. sistema, leidžia kurti ir saugoti užduočių metodus atminties parametruose. Jie atitinka "Pavyzdinės laboratorinės praktikos" (GLP) kriterijus ir yra įtraukti į Rusijos Federacijos matavimo priemonių registrą. Matavimo protokolai išduodami pagal Anglijos, JAV, Vokietijos ir Prancūzijos farmakopėjas.
TSP modulinės sistemos pasižymi didžiausiu patikimumu ir stabilumu eksploatuojant.
Modulių derinys suteikia analitikui visus integruotos sistemos privalumus ir, kita vertus, modulinės sistemos lankstumą. Nepriklausomai nuo didelio efektyvumo skysčių chromatografijos (HPLC) taikymo srities – farmakologijos, biotechnologijų, aplinkos analizės, klinikinės analizės, maisto ir gėrimų analizės, naftos chemijos ir cheminės analizės – šis instrumentas yra naudojamas, jis visada yra optimaliai sukonfigūruotas, kad atitiktų aukščiausius reikalavimus. .
Tiek tyrimų, tiek didelio našumo įprastinės sistemos suteikia:
Labai efektyvus tirpiklio degazavimas
Gebėjimas dirbti su mažais ir itin mažais mėginių kiekiais
Didžiausias jautrumas, tiek su UV/VIS detektoriumi, tiek su diodų matrica (su garsiąja LightPipe technologija su 1 arba 5 cm optinio kelio ilgio pasirinkimu)
Darbas su skirtingais stulpeliais
Didžiausias kiekybinis tikslumas
Galimybė dirbti automatiškai su skirtingais mėginių kiekiais
RMS sulaikymo laiko paklaida mažesnė nei 0,3 %
Minimumas darbo zona užimta sistemos
Didžiausias patikimumas ir parametrų stabilumas.
Surveyor LC siurblys- HPLC siurblys su geriausiu sulaikymo laiko atkuriamumu iš bet kurio 4 komponentų gradiento siurblio pasaulyje. Integruotas keturių kanalų vakuuminis degazatorius ir pulsacijos slopintuvas užtikrina puikų bazinės linijos stabilumą, kad būtų pasiektas maksimalus kiekybinio nustatymo jautrumas ir tikslumas.
Automatinis mėginių ėmiklis užtikrina didžiausią našumą ir analizės lankstumą. Platus mėginių padėklų asortimentas – nuo standartinių buteliukų iki 96 ir 384 šulinėlių mikroplokštelių – patenkina praktiškai visų pritaikymų poreikius. Nauja technologija beveik nepraranda mėginio įpurškimo, beveik 5 µl mėginio įšvirkščiama automatiniu mėginių ėmimo įrenginiu iš viso 5 µl mėginio tūrio.
TYRĖJAS
UV / vaizdo detektorius ir PDA (diodų matricos detektorius)
Matininkas UV/Vis- Kintamo bangos ilgio ultravioletinės ir matomos šviesos detektorius yra ekonomiškumo ir patikimumo derinys su aukščiausio jautrumo LightPipe technologija. Dėl plataus srauto elementų pasirinkimo šis detektorius yra universalus visoms reikmėms, pradedant nuo kapiliarinės ar mikrokoloninės chromatografijos iki pusiau paruošiamosios ir preparatinės.
Surveyor PDA Detektorius yra jautriausias tarp visų HPLC diodų matricos detektorių. Dviejų lempų šaltinio optika sklandžiai apima visą bangos ilgių diapazoną nuo 190 iki 800 nm. Šviesolaidinis pluošto formuotojas užtikrina puikią optinę skiriamąją gebą neprarandant jautrumo.
Matininkas RI refraktometrinis detektorius su minimalaus tūrio termostatu kiuvete su pilnu elektroniniu valdymu iš kompiuterio.
Matininkas FL Fluorometrinis skenavimo detektorius, pasižymintis didžiausiu jautrumu ir galimybe aptikti fluorescenciją, chemiliuminescenciją ir fosforescenciją.
Platus automatinių mėginių ėmimo įrenginių asortimentas leidžia dirbti tiek su įprastais buteliukais, tiek su 96 pozicijų plokštelėmis, plačiai naudojamais biochemijoje ir klinikinėje praktikoje. Tvarkymą palengvina panašios SPE mėginių paruošimo plokštelės.
400 Elektrinė pavara, Valco kilpa (20 µl – standartinis) su galimybe iš dalies užpildyti.
Karuselė 96 pavyzdžiai.
Elektrinė pavara, kolonėlės termostatas, Valco kilpa (100 µl - standartinis) su dalinio užpildymo galimybe.AutoMix režimas mėginio paruošimui. Mėginių karuselė: 84 x 2 ml (mėginiai) + 3 x 10 ml (reagentai). Integruotas kolonėlės termostatas. 420
Automatinis kilpos mėginių ėmiklis tiriamasis darbas su galimybe dirbti pilno, dalinio užpildymo ir mikrolitrų mėginių įvedimo režimais. Platus karuselių asortimentas (standartinis – 96 pavyzdžiai).
Planšetinis kompiuteris, skirtas 96 ir 384 padėčių plokštelėms. Mėginio įpurškimas į slėgio kilpą, galimybė įvesti mažesnius nei 1 µl mėginius. Galimybė įsirengti planšetės tiektuvą. HPLC
Pagrindiniai HPLC įrangos gamintojai
· Vandenys – efektyvi chromatografija, masių spektrometrija, kolonėlės, kietosios fazės ekstrahavimas;
Varian, Inc. - chromatografai ir kolonėlės, kietosios fazės ekstrahavimo priedai;
· Agilent Technologies – chromatografai ir kolonėlės;
· Hypersil – kolonėlės ir sorbentai.
· Merck KGaA - TLC plokštės ir priedai TLC, kolonėlės, sorbentų mobiliosios fazės HPLC, priedai kietosios fazės ekstrahavimui
· Dionex – HPLC įranga ir kolonėlės, ypač jonų chromatografijai.
Literatūra
1.Pilipenko A.T., Pyatnitsky I.V. Analitinė chemija. Dviejose knygose: kn..1 - M .: Chemija, 1990, -480 m.
1. Pilipenko A.T., Pyatnitsky I.V. Analitinė chemija. Dviejose knygose: kn..2 - M .: Chemija, 1990, -480 m.
2. Vasiljevas V.P. Analitinė chemija. 14 val. 2 dalis. Fizikiniai ir cheminiai analizės metodai: Proc. už Khimko - technol. specialistas. universitetai. - M .: Aukštesnis. mokykla, 1989. - 384p.
3. Hidrocheminės medžiagos. Tomas 100. Paviršinio vandens kokybės operatyvinio monitoringo metodai ir techninės priemonės. L.: Gidrometeo-izdat, 1991. - 200p.
4. Lurie Yu.Yu. Pramoninių nuotekų analitinė chemija / Yu.Yu. Lurie; M.: Chemija Yu, 1984. - 448s.
5. Ewingas G. Instrumentiniai cheminės analizės metodai / Per. iš anglų kalbos. M.: Mir, 1989. - 348 p.
6. Gorelik D.O., Konopelko L.A., Pankov E.D. Aplinkos monitoringas. 2 t. Sankt Peterburgas: Kalėdos. 2000. - 260 p.
7. Aivazovas B.V. Įvadas į chromatografiją. M.: Aukščiau. mokykla, 1983. - 450 p.
8. Goldberg K.A., Vigdergauz M.S. Įvadas į dujų chromatografiją. M.: Chemija, 1990. - 329 p.
9. Stolyarov B.V. ir kiti // Praktinė dujų ir skysčių chromatografija. Sankt Peterburgas: Sankt Peterburgo valstybinis universitetas, 1998. - S. 81.
11. Gorškovas A.G., Marinaite I.I. HPLC – PAH stebėjimo metodas aplinkos objektuose
12. Torosyan G. O., Martirosyan V. A., Aleksanyan A. R., Zakaryan M. O. Anilino pašalinimas iš vandeninių tirpalų, naudojant riedėjimo vario apnašų aliuminoterminio redukavimo atliekas
13. L.A. Turkina, G.N. Koroleva Šarminių žemių elementų ir magnio nustatymo jonų didelio efektyvumo skysčių chromatografijos metodo sukūrimas
14. Dultseva G.G., Dubcova Yu.Yu., Skubnevskaya G.I. Kadmio kompleksų aplinkoje analizė
Taikymas
KLOMAZONO NUSTATYMAS VANDENYJE CHROMATOGRAFIJOS METODAIS
METODINIAI NURODYMAI MUK 4.1.1415-03
1. Parengė: Federalinis mokslinis higienos centras. F.F.
Erismanas; Maskvos žemės ūkio akademija. K.A.
Timiriazevas; dalyvaujant Rusijos sveikatos apsaugos ministerijos Valstybinės sanitarinės ir epidemiologinės priežiūros departamentui. Metodikos kūrėjai pateikiami pabaigoje.
3. Patvirtino vyriausiasis valstybinis sanitarijos gydytojas
Rusijos Federacija, pirmasis Rusijos Federacijos sveikatos apsaugos ministro pavaduotojas, akad. RAMS G.G. Oniščenka 2003 m. birželio 24 d
5. Pristatytas pirmą kartą.
1. Įvadas
Gamintojas: FMS (JAV).
Prekės pavadinimas: COMMAND.
Veiklioji medžiaga: klomazonas.
2-(2-chlorbenzil)-4,4-dimetil-3-izoksalidin-3-onas (IUPAC)
Šviesiai rudas klampus skystis.
Lydymosi temperatūra: 25 -C.
Virimo temperatūra: 275 -C.
Garų slėgis 25 -C temperatūroje: 19,2 MPa.
Pasiskirstymo koeficientas n-oktanolis/vanduo: K logP = 2,5.
Labai gerai tirpsta acetone, heksane, etanolyje, metanolyje,
chloroformas, dichlormetanas ir acetonitrilas; tirpumas vandenyje -
1,10 g/kub. dm. Stabilus kambario temperatūroje ne trumpiau kaip 2 metus, 50 -C – mažiausiai 3 mėnesius.
Trumpas toksikologinis profilis: Ūmus oralinis
toksiškumas (LD) žiurkėms - 1369 - 2077 mg/kg; ūminis derminis
toksiškumas (LD) žiurkėms – daugiau kaip 2000 mg/kg; ūminis
inhaliacinis toksiškumas (LC) žiurkėms - 4,8 mg / kub. dm (4 valandos).
Higienos standartai. MPC vandenyje - 0,02 mg / kub. dm.
Vaisto taikymo sritis. Klomazonas yra selektyvus herbicidas, naudojamas javams ir dviskiltėms piktžolėms naikinti sojos pupelių ir ryžių pasėliuose prieš dygimą arba prieš sėją.
2. Klomazono nustatymo vandenyje metodas
chromatografijos metodai
2.1. Pagrindinės nuostatos
2.1.1. Technikos principas
Metodas pagrįstas klomazono ekstrahavimu iš analizuojamo mėginio heksanu, ekstrakto koncentravimu ir vėlesniu kiekybiniu nustatymu alternatyviais metodais:
didelio efektyvumo skysčių chromatografija (HPLC) su
ultravioletinis detektorius, dujų skysčių chromatografija (GLC) su pastovaus rekombinacijos greičio detektoriumi arba plonasluoksnė chromatografija (TLC). Kiekybinis nustatymas atliekamas absoliutaus kalibravimo metodu.
2.1.2. Metodo selektyvumas
Siūlomomis sąlygomis metodas yra specifinis esant globaliems aplinkos teršalams: chlorinti cikloparafinų dariniai (HCH izomerai), difenilo junginiai (DDT ir jo dariniai), jų metabolitai – polichlorinti benzenai ir fenoliai, taip pat esant natrio trichloracetatas, kuris gali būti naudojamas pasėliams kaip herbicidas.
2.1.3. Metrologinė metodo charakteristika (P = 0,95)
Reagentai, tirpalai ir medžiagos
Klomazonas, kurio sudėtyje yra d. 99,8 %
(FMS, JAV)
Azotas ir GOST 9293-79
Vandens amoniakas, 25%, h GOST 1277-81
Acetonas, h GOST 2603-79
n-heksanas, h GOST 2603-79
Vandenilio peroksidas, 30% vandeninis tirpalas GOST 10929-77
Izopropilo alkoholis, chemiškai grynas TU 6-09-402-75
Sieros rūgštis, chemiškai gryna GOST 4203-77
Vandenilio chlorido rūgštis (druskos rūgštis), chemiškai gryna GOST 3118-77
Metilo alkoholis, chemiškai grynas GOST
Natrio hidroksidas, chemiškai grynas, 25% vandeninis tirpalas GOST 4323-77
Bevandenis natrio sulfatas, chemiškai grynas GOST 1277-81
Sidabro nitratas, chemiškai grynas GOST 1277-81
2-fenoksimetanolis, h TU 6-09-3688-76
„Chromaton N-AW-DMCS“ (0,16–0,20 mm)
su 5% SE-30, Hemapol, Čekija
Chromaton N-AW-DMCS (0,16–0,20 mm) su 1,5
OV-17 + 1,95 % QF-1, Hemapol, Čekija
HPTLC plokštės (SSRS)
Įrašai "Kieselgel 60 F-254" (Vokietija)
Įrašai "Silufol" Čekijoje
Popieriniai filtrai "balta juosta", bepeleniai ir iš anksto išplauti heksanu TU 6-09-2678-77
2.3. Stalo įrankiai, įranga, indai
Skysčių chromatografas Milichromas
su UV detektoriumi
Chromatografinė plieno kolonėlė,
ilgis 64 mm, vidinis skersmuo 2 mm,
užpildytas Silasorb 600, grūdelių dydis 5 µm
Dujų chromatografų serija „Spalva“ arba
panašus, su nuolatiniu detektoriumi
rekombinacijos greitis (RPR) su riba
aptikimas lindanu 4 x 10 g/kub. cm
Chromatografinė stiklo kolonėlė, ilgis
1 arba 2 m, vidinis skersmuo 2 - 3 mm
MSH-10 tipo mikrošvirkštas, talpa 10 µl TU 5E2-833-024
Aparatas kratymui tipo AVU-6s TU 64-1-2851-78
Vandens vonia TU 64-1-2850-76
Analitinės svarstyklės tipas VLA-200 GOST 34104-80E
Chromatografinė kamera GOST 10565-74
Vandens srovės siurblys GOST 10696-75
Gyvsidabrio-kvarco švitintuvas OKN-11 TU 64-1-1618-77
Stiklo purškimo pistoletai GOST 10391-74
Rotacinis vakuuminis garintuvas IR-1M
arba panašus TU 25-11-917-76
Kompresoriaus blokas TU 64-1-2985-78
Džiovinimo spinta TU 64-1-1411-76E
Dalijamieji piltuvėliai GOST 3613-75
100 ml talpos matavimo kolbos GOST 1770-74
Matavimo cilindrai, kurių talpa 10,50 ml GOST 1770-74E
Kriaušės formos kolbos su plonu skyriumi,
100 ml talpos GOST 10394-72
Kolbos kūginės, 100 ml talpos GOST 22524-77
Centrifuginiai mėgintuvėliai, išmatuoti GOST 25336-82E
Pipetės, kurių talpa 0,1, 1, 2, 5 ir 10 ml GOST 20292-74
Cheminiai piltuvėliai, kūginiai, skersmens
34 - 40 mm GOST 25336-82E
2.4. Mėginio pasirinkimas
Mėginių ėmimas, laikymas ir ruošimas vykdomas pagal
„Vieningos žemės ūkio produktų, maisto produktų ir aplinkos objektų mėginių ėmimo pesticidų pėdsakams nustatymo taisyklės“, patvirtintos 79-08-21 N 2051-79.
Paimtus mėginius galima laikyti šaldytuve iki 5 dienų. Prieš analizę vanduo (esant suspensijai) filtruojamas per popierinį filtrą.
2.5. Pasiruošimas apibrėžimui
2.5.1. HPLC metodas
2.5.1.1. Mobiliosios fazės paruošimas HPLC
Į 100 ml talpos matavimo kolbą pipete įpilama 5 ml izopopanolio ir 5 ml metanolio, iki žymės įpilama heksano, sumaišoma, filtruojama.
2.5.1.2. Stulpelio kondicionavimas
Skalauti HPLC kolonėlę heksano-metanolio-izopropanoliu (90:5:5, v/v) 30 min. esant 100 µl/min tirpiklio padavimo greičiui.
2.5.2. GLC metodas. Kolonėlės paruošimas ir kondicionavimas
Pagaminta pakuotė (5% SE-30 ant Chromaton N-AW-DMCS) supilama į stiklinę kolonėlę, sutankinama vakuume, kolonėlė įmontuojama į chromatografo termostatą, nejungiama prie detektoriaus ir stabilizuojama azoto sraute. 250 -C temperatūroje 10 - 12 val
2.5.3. TLC metodas
2.5.3.1. Ryškiųjų reagentų paruošimas
2.5.3.1.1. Kūrimo reagentas Nr. 1
1 g sidabro nitrato ištirpinama 1 ml distiliuoto vandens, įpilama 10 ml 2-fenoksimetanolio, 190 ml acetono, 1-2 lašai vandenilio peroksido, tirpalas išmaišomas ir supilamas į tamsaus stiklo butelį.
2.5.3.2.2. Kūrimo reagentas N 2
0,5 g sidabro nitrato ištirpinama 5 ml distiliuoto vandens 100 ml matavimo kolboje, įpilama 10 ml 25 % amoniako vandeninio tirpalo, tirpalas sureguliuojamas iki 100 ml acetonu, sumaišomas ir supilamas į tamsaus stiklo butelį.
2.5.3.2. Mobiliosios fazės paruošimas TLC
Į 100 ml talpos matavimo kolbą įpilkite 20 ml acetono ir iki žymės įpilkite heksano, išmaišykite. Mišinys per 30 minučių supilamas į chromatografinę kamerą ne didesniu kaip 6–8 mm sluoksniu. Prieš pradedant chromatografiją.
2.5.4. Standartinių tirpalų ruošimas
100 µg/mL klomazono pradinis etaloninis tirpalas paruošiamas ištirpinant 0,010 g preparato, kuriame yra 99,8 % AI, heksane 100 ml matavimo kolboje. Tirpalas laikomas šaldytuve mėnesį.
Darbiniai standartiniai tirpalai, kurių koncentracija 0,4; 1,0; 2,0; 4,0; 10,0; 20 ir 40,0 µg/ml paruošiami iš klomazono pradinio etaloninio tirpalo, atitinkamais serijos praskiedimais heksanu.
Darbiniai tirpalai šaldytuve laikomi ne ilgiau kaip mėnesį.
2.5.5. Kalibravimo grafiko konstravimas
2.5.5.1. Kalibravimo kreivė A (matavimas pagal 2.7.1 pastraipą, HPLC)
Norint sudaryti kalibravimo grafiką, į chromatografo injektorių įpurškiama 5 µl darbinio etaloninio klomazono tirpalo, kurio koncentracija 4,0; 10,0; 20,0 ir 40 µg/ml.
2.5.5.2. Kalibravimo kreivė B (matavimas pagal 2.7.2 pastraipą, GLC)
Norint sudaryti kalibravimo grafiką, į chromatografo garintuvą įpurškiama 5 µl darbinio etaloninio klomazono tirpalo, kurio koncentracija 0,4; 1,0; 2,0; 4.0 ir 10.0.
Atlikite bent 5 lygiagrečius matavimus. Raskite kiekvienos koncentracijos chromatografinės smailės vidutinį aukštį. Sudarykite chromatografinės smailės aukščio priklausomybės mm nuo klomazono koncentracijos tirpale µg/ml kalibravimo grafiką (A arba B).
2.6. Apibrėžimas Aprašymas
100 ml tiriamo vandens mėginio dedama į 250 ml talpos dalijamąjį piltuvą, įpilama 10 ml 25 % vandeninio natrio hidroksido tirpalo, išmaišoma ir įpilama 20 ml n-heksano. Piltuvėlis kratomas 3 minutes, po fazių atskyrimo heksano sluoksnis supilamas į kriaušės formos 100 ml talpos kolbą, perleidžiant per bevandenio natrio sulfato sluoksnį, įdėtą į kūginį piltuvėlį ant klostuoto filtravimo popieriaus. Vaisto ekstrahavimas iš vandeninio mėginio kartojamas dar du kartus, naudojant 20 ml n-heksano. Sujungtas heksano ekstraktas išgarinamas rotaciniame vakuuminiame garintuve 40 -C temperatūroje beveik iki sausumo, likučiai nupučiami ypatingo grynumo oro arba azoto srove. Sausa liekana ištirpinama 0,1 (HPLC, TLC) arba 0,25 ml (GLC) n-heksane ir analizuojama vienu iš chromatografinių metodų.
2.7. Chromatografijos sąlygos
Skysčių chromatografas su ultravioletinių spindulių detektoriumi Milichrom (Rusija).
Plieninė kolona 64 mm ilgio, vidinis skersmuo 2 mm,
užpildytas Silasorb 600, grūdelių dydis 5 mikronai.
Kolonėlės temperatūra: kambarys.
Judanti fazė: heksanas-izopropanolis-metanolis (90:5:5, v/v).
Eliuento srautas: 100 µl/min.
Darbinis bangos ilgis: 240 nm.
Jautrumas: 0,4 vnt absorbcija skalėje.
Įpurškiamas tūris: 5 µl.
Clomazone išėjimo laikas: apie 6 min.
Linijinis aptikimo diapazonas: 20 - 200 ng.
Mėginiai, kurių smailės didesnės nei 40 µg/mL standartinio tirpalo, skiedžiami HPLC judriąja faze.
Dujų chromatografas „Tsvet-570“ su pastovaus jonų rekombinacijos greičio detektoriumi.
Stiklo kolonėlė 1 m ilgio, 3 mm vidinio skersmens, užpildyta Chromaton N-AW-DMCS su 5% SE-30 (0,16 - 0,20 mm).
Elektrometro darbinė skalė yra 64 x 10 10 omų.
Įrašymo juostos greitis 200 mm/val.
Kolonėlės termostato temperatūra - 190 -С
detektorius - 300 -C
garintuvas - 220 -C
Nešančių dujų (azoto) greitis – 60 ml/min.
Suleidžiamo mėginio tūris yra 5 µl.
Klomazono išėjimo laikas yra 2,5 minutės.
Linijinis aptikimo diapazonas: 2 - 50 ng.
Mėginiai, kurių smailės viršija 10 µg/mL standartinio tirpalo, skiedžiamos heksanu.
Siekiant pagerinti klomazono identifikavimo tikslumą, kai mėginyje yra gama-HCCH, kurio sulaikymo laikas yra artimas, klomazonas pašalinamas iš mėginio apdorojant koncentruota sieros rūgštimi. Pakartotinė mėginio analizė leidžia nustatyti klomazono indėlį į pirminį chromatografinį signalą.
Heksano tirpalas kolboje, kiekybiškai gautas pagal 2.6 skirsnį
(arba jo alikvotinė dalis) dedama ant chromatografinių plokštelių „Silufol“, „Kieselgel 60F-254“ arba „Plokštelės HPTLC“. Netoliese naudojami standartiniai tirpalai, kurių tūris atitinka 1, 2, 5 ir 10 μg klomazono kiekį. Plokštelė dedama į chromatografinę kamerą, kurioje yra n-heksano ir acetono mišinys (4:1, v/v). Išryškinus chromatogramą, plokštelė išimama iš kameros, dedama į trauką, kol tirpikliai išgaruos, tada apdorojama vienu iš ryškinimo reagentų ir 5 minutėms dedama po ultravioletine lempa. Vaisto lokalizacijos zona plokštelėse „Silufol“, „Plokštelės HPTLC“ ir „Kieselgel 60F-254“ atrodo kaip pilkai rudos dėmės, kurių Rf reikšmės yra atitinkamai 0,35, 0,85 ir 0,43. Norėdami nustatyti klomazoną TLC, galite naudoti plokšteles „Alugram“ ir „Polygram“ (gaminta Vokietija). Klomazono Rf reikšmė šiose plokštelėse yra atitinkamai 0,37 ir 0,38.
3. Saugos reikalavimai
Dirbant su organiniais tirpikliais, toksiškomis medžiagomis, elektriniais šildytuvais būtina laikytis visuotinai priimtų saugos taisyklių.
4. Matavimo klaidų kontrolė
Eksploatacinė matavimų paklaidos ir atkuriamumo kontrolė vykdoma pagal MI 2335-95 rekomendacijas. GSI „Kiekybinės cheminės analizės rezultatų vidinė kokybės kontrolė“.
5. Kūrėjai
Yudina T.V., Fedorova N.E. (FNTSG pavadintas F. F. Erismano vardu).
Davidyuk E.I. (UkrNIIGINTOX, Kijevas); Kisenko M.A., Demčenko V.F. (Mokslų akademijos ir Ukrainos medicinos mokslų akademijos Darbo medicinos institutas, Kijevas).
Skysčių adsorbcijos chromatografija kolonėlėje
Medžiagų mišinio atskyrimas adsorbcijos kolonėlėje įvyksta dėl to, kad skiriasi jų sorbingumas tam tikrame adsorbente (pagal M. S. Tsvet nustatytą adsorbcijos pakeitimo įstatymą).
Adsorbentai yra porėti kūnai su labai išvystytu vidiniu paviršiumi, kurie sulaiko skysčius per tarpmolekulinius ir paviršiaus reiškinius. Tai gali būti poliniai ir nepoliniai neorganiniai ir organiniai junginiai. Prie polinių adsorbentų priskiriamas silikagelis (džiovintas želatininis silicio dioksidas), aliuminio oksidas, kalcio karbonatas, celiuliozė, krakmolas ir kt. Nepoliniai sorbentai – aktyvuota anglis, gumos milteliai ir daugelis kitų, gaunamų sintetiniu būdu.
Adsorbentams taikomi šie reikalavimai: S jie neturi kelti cheminių reakcijų su judančia faze ir atskirtomis medžiagomis; S turi turėti mechaninį stiprumą; Adsorbento S grūdeliai turi būti vienodo dispersijos laipsnio.
Renkantis chromatografinio proceso sąlygas, atsižvelgiama į adsorbento ir adsorbuojamų medžiagų savybes.
Klasikinėje skysčių kolonėlės chromatografijos (LCC) versijoje eliuentas (PF) leidžiamas per chromatografinę kolonėlę, kuri yra 0,5–5 cm skersmens ir 20–100 cm ilgio stiklinis vamzdelis, užpildytas sorbentu (NF). Eliuentas juda veikiamas gravitacijos. Jo judėjimo greitį galima reguliuoti kolonos apačioje esančiu kranu. Tiriamas mišinys dedamas kolonėlės viršuje. Mėginiui judant per kolonėlę komponentai atsiskiria. Tam tikrais intervalais paimamos iš kolonėlės išsiskiriančios eliuento frakcijos, kurios analizuojamos bet kokiu metodu, leidžiančiu išmatuoti analičių koncentracijas.
Kolonėlės adsorbcinė chromatografija šiuo metu naudojama daugiausia ne kaip savarankiškas analizės metodas, o kaip preliminaraus (kartais galutinio) sudėtingų mišinių atskyrimo į paprastesnius, t.y. pasirengti analizei kitais metodais (įskaitant chromatografiją). Pavyzdžiui, aliuminio oksido kolonėlėje atskiriamas tokoferolių mišinys, praleidžiamas eliuentas, o α-tokoferolio frakcija surenkama tolesniam fotometriniam nustatymui.
Chromatografinis mišinio atskyrimas ant kolonėlės dėl lėto PF judėjimo užtrunka ilgai. Siekiant pagreitinti procesą, chromatografija atliekama esant slėgiui. Šis metodas vadinamas didelio efektyvumo skysčių chromatografija (HPLC).
Modernizavus klasikinėje skysčių kolonėlių chromatografijoje naudojamą įrangą, ji tapo viena perspektyviausių ir šiuolaikiniai metodai analizė. Didelio efektyvumo skysčių chromatografija yra patogus nelakiųjų, termolabiųjų mažos ir didelės molekulinės masės junginių atskyrimo, preparatinio išskyrimo ir kokybinės bei kiekybinės analizės metodas.
Priklausomai nuo naudojamo sorbento tipo, šiuo metodu naudojamos 2 chromatografijos galimybės: ant polinio sorbento, naudojant nepolinį eliuentą (tiesioginės fazės pasirinkimas), ir su nepoliniu sorbentu, naudojant polinį eliuentą – vadinamąjį atvirkštinės fazės aukštą eliuentą. - efektyvioji skysčių chromatografija (RP HPLC).
Kai eliuentas pereina į eliuentą, pusiausvyra RPHLC sąlygomis nusistovi daug kartų greičiau nei polinių sorbentų ir nevandeninių PF sąlygomis. Dėl to, taip pat dėl patogumo dirbti su vandeniu ir vandens-alkoholio eliuentais, RPHLC dabar įgijo didelį populiarumą. Dauguma HPLC analizių atliekamos naudojant šį metodą.
HPLC prietaisai
Šiuolaikinės HPLC įrangos komplektas, kaip taisyklė, susideda iš dviejų siurblių 3,4 (7.1.1.1 pav.), valdomų mikroprocesoriaus 5 ir tiekiančių eliuentą pagal specialią programą. Siurbliai sukuria slėgį iki 40 MPa. Mėginys įpurškiamas per specialų prietaisą (purkštuką) 7 tiesiai į eliuento srautą. Perėjus per chromatografinę kolonėlę 8, medžiagos aptinkamos itin jautriu srauto detektoriumi 9, kurio signalą registruoja ir apdoroja mikrokompiuteris 11. Prireikus frakcijos parenkamos automatiškai piko išėjimo metu.
Kolonėlės HPLC yra pagamintos iš nerūdijančio plieno, kurio vidinis skersmuo 2 - 6 mm ir ilgis 10-25 cm Kolonėlės užpildytos sorbentu (NF). Kaip NF naudojamas silikagelis, aliuminio oksidas arba modifikuoti sorbentai. Silikagelis dažniausiai modifikuojamas į jo paviršių chemiškai įvedant įvairias funkcines grupes.
Detektoriai. Atskiro komponento stulpelio išvesties registracija atliekama naudojant detektorių. Registruodami galite naudoti bet kurio analitinio signalo, gaunamo iš judriosios fazės, pasikeitimą, susijusį su mišinio komponento pobūdžiu ir kiekiu. Skysčių chromatografijoje naudojami tokie analitiniai signalai kaip išeinančio tirpalo šviesos sugertis arba šviesos emisija (fotometriniai ir fluorimetriniai detektoriai), lūžio rodiklis (refraktometriniai detektoriai), potencialas ir elektrinis laidumas (elektrocheminiai detektoriai) ir kt.
Nuolat aptinkamas signalas įrašomas diktofono. Chromatograma – magnetofonu įrašytų detektoriaus signalų seka, kuri sukuriama atskiriems mišinio komponentams paliekant kolonėlę. Mišinio atskyrimo atveju išorinėje chromatogramoje matomos atskiros smailės. Smailės padėtis chromatogramoje naudojama medžiagai identifikuoti, smailės aukštis arba plotas – kiekybiniam nustatymui.
Kokybinė analizė
Svarbiausios chromatogramos charakteristikos – sulaikymo laikas tR ir su ja susijęs sulaikymo tūris – atspindi medžiagų prigimtį, jų gebėjimą sorbuotis ant nejudančios fazės medžiagos, todėl pastoviomis chromatografijos sąlygomis jos yra medžiagos identifikavimo priemones. Tam tikroje kolonėlėje su tam tikru srautu ir temperatūra kiekvieno junginio sulaikymo trukmė yra pastovi (7.1.1.2 pav.), kur t.R(A) yra analizuojamo mišinio komponento A sulaikymo laikas nuo jo įpurškimo momento. kolonėlė tol, kol kolonėlės išėjimo angoje atsiranda didžiausia smailė, 1K(ss) – vidinio etalono sulaikymo laikas (medžiagos, kurios iš pradžių nebuvo tiriamame mišinyje), h – smailės aukštis (mm), ab – smailės plotis per pusę jo aukščio, mm.
Norint identifikuoti medžiagą pagal chromatogramą, paprastai naudojami standartiniai mėginiai arba grynos medžiagos. Palyginkite nežinomo IR* komponento sulaikymo trukmę su žinomų medžiagų IRCT sulaikymo trukme. Tačiau patikimesnis identifikavimas matuojant santykinį sulaikymo laiką
Tokiu atveju pirmiausia į kolonėlę įvedama žinoma medžiaga (vidinis standartas) ir išmatuojama jos sulaikymo trukmė tR(Bc), po to tiriamasis mišinys chromatografiškai atskiriamas (chromatografuojamas), į kurį preliminariai pridedamas vidinis standartas. Santykinė sulaikymo trukmė nustatoma pagal (7.1.1.1) formulę.
Kiekybinė analizė
Ši analizė pagrįsta smailės aukščio h arba jo ploto S priklausomybe nuo medžiagos kiekio. Siauroms smailėms geriau matuoti h, plačioms neryškioms smailėms – S. Smailės plotas matuojamas įvairiais būdais: smailės aukštį (h) padauginus iš jos pločio (ai / 2), išmatuotą ties puse aukščio (1 pav.). 7.2.3); planavimas; naudojant integratorių. Šiuolaikiniai chromatografai aprūpinti elektriniais arba elektroniniais integratoriais.
Medžiagų kiekiui mėginyje nustatyti daugiausia naudojami trys metodai: absoliutaus kalibravimo metodas, vidinio normalizavimo metodas ir vidinio standarto metodas.
Absoliutus kalibravimo metodas pagrįstas preliminariu ryšio tarp įterptos medžiagos kiekio ir smailės ploto arba aukščio chromatogramoje nustatymu. Į chromatogramą įpilamas žinomas kalibravimo mišinio kiekis ir nustatomi gautų smailių plotai arba aukščiai. Iš suleistos medžiagos kiekio sukurkite smailės ploto arba aukščio grafiką. Tiriamasis mėginys išanalizuojamas, išmatuojamas nustatomo komponento smailės plotas arba aukštis, pagal kalibravimo kreivę apskaičiuojamas jo kiekis.
Šis metodas suteikia informaciją tik apie santykinį komponento kiekį mišinyje, tačiau neleidžia nustatyti jo absoliučios vertės.
Vidinio standarto metodas pagrįstas pasirinkto analitės smailės parametro palyginimu su tuo pačiu etaloninės medžiagos, įvestos į mėginį žinomu kiekiu, parametru. Į bandinį įpilamas žinomas tokios standartinės medžiagos kiekis, kurio smailė pakankamai gerai atskirta nuo tiriamojo mišinio komponentų smailių.
Paskutiniai du metodai reikalauja įvesti korekcijos koeficientus, apibūdinančius detektorių, naudojamų analizuojamoms medžiagoms, jautrumą. Skirtingų tipų detektoriams ir skirtingoms medžiagoms jautrumo koeficientas nustatomas eksperimentiniu būdu.
Skysčių adsorbcinė chromatografija taip pat naudoja tirpalų frakcijų, surinktų tuo metu, kai medžiaga išeina iš kolonėlės, analizę. Analizė gali būti atliekama įvairiais fizikiniais ir cheminiais metodais.
Skysčių adsorbcinė chromatografija pirmiausia naudojama organinėms medžiagoms atskirti. Šis metodas labai sėkmingas tiriant aliejaus, angliavandenilių sudėtį, efektyviai atskiriant trans- ir cis-izomerus, alkaloidus ir kt. HPLC gali būti naudojamas dažams, organinėms rūgštims, aminorūgštims, cukrui, pesticidų ir herbicidų priemaišoms, vaistinėms medžiagoms nustatyti. ir kiti maisto produktuose esantys teršalai.
(OFS 42-0096-09)
Didelio efektyvumo skysčių chromatografija (HPLC) yra kolonėlės chromatografijos metodas, kai judanti fazė (MP) yra skysta
kaulas, judantis per chromatografinę kolonėlę, užpildytą be atramos
regėjimo fazė (sorbentas). HPLC kolonėlės pasižymi dideliu hidrauliniu slėgiu kolonėlės įėjimo angoje, todėl kartais vadinama HPLC
vadinamas „aukšto slėgio skysčių chromatografija“.
Atsižvelgiant į medžiagų atskyrimo mechanizmą, išskiriami:
bendrosios HPLC parinktys: adsorbcija, paskirstymas, jonų mainai,
išskirtinis, chiralinis ir kt.
Atliekant adsorbcinę chromatografiją, medžiagos atsiskiria dėl skirtingo jų gebėjimo adsorbuotis ir desorbuotis didėjant.
adsorbento paviršius su išvystytu paviršiumi, pavyzdžiui, silikagelis.
Pasidalijimo HPLC metu atskyrimas įvyksta dėl atskirtinų medžiagų pasiskirstymo koeficientų skirtumo tarp nejudančių medžiagų.
(dažniausiai chemiškai skiepijama ant fiksuoto nešiklio paviršiaus) ir
judriosios fazės.
Pagal poliškumą PF ir NF HPLC skirstomi į normalios fazės ir ob-
fazinis sukimasis.
Normalioji fazė vadinamas chromatografijos variantu, kuriame
naudokite polinį sorbentą (pavyzdžiui, silikagelį arba silikagelį, į kurį pridėta
susuktos NH2 arba CN grupės) ir nepolinis PF (pavyzdžiui, heksanas su skirtingais
asmeniniai priedai). Atvirkštinės fazės chromatografijos variante
naudoti nepolinius chemiškai modifikuotus sorbentus (pvz.
nepolinis alkilo radikalas C18) ir polinės judriosios fazės (pavyzdžiui,
metanolis, acetonitrilas).
Jonų mainų chromatografijoje mišinio medžiagų molekulės, disociacija
tirpale į katijonus ir anijonus, judant per juos atskiriami
sorbentas (katijonų arba anijonų keitiklis) dėl skirtingo keitimo kurso su joniniais
mi sorbento grupės.
Išskyrus (sietas, prasiskverbiantis į gelį, gelio filtravimas)
Chromatografinės medžiagų molekulės yra atskiriamos pagal dydį dėl skirtingo jų gebėjimo prasiskverbti į stacionarios fazės poras. Tuo pačiu metu pirmasis iš
iš kolonėlių išeina didžiausios molekulės (didžiausios molekulinės masės), kurios gali prasiskverbti į mažiausią stacionarios fazės porų skaičių,
o medžiagos, kurių molekulės yra mažos, išeina paskutinės.
Dažnai atskyrimas vyksta ne vienu, o keliais mechanizmais vienu metu.
HPLC metodas gali būti naudojamas bet kokio neigiamo poveikio kokybei kontroliuoti.
panašios analitės. Analizei naudojami atitinkami instrumentai – skysčių chromatografai.
Skysčių chromatografo sudėtis paprastai apima šiuos pagrindinius elementus
mazgai:
– PF paruošimo įrenginys, įskaitant talpyklą su mobiliąja faze (arba talpyklą
sti su atskirais tirpikliais, kurie yra judriosios fazės dalis
zy) ir PF degazavimo sistema;
– siurbimo sistema;
– judriosios fazės maišytuvas (jei reikia);
– mėginio įpurškimo sistema (injektorius);
– chromatografinė kolonėlė (galima montuoti termostate);
– detektorius;
– duomenų rinkimo ir apdorojimo sistema.
Siurbimo sistema
Siurbliai tiekia PF į kolonėlę tam tikru pastoviu greičiu. Judančios fazės sudėtis gali būti pastovi arba kintama.
analizės metu. Pirmuoju atveju procesas vadinamas izokratiniu,
o antroje – gradientas. Kartais montuojamas prieš siurbimo sistemą
filtrai, kurių porų skersmuo 0,45 µm, skirti filtruoti judančią fazę. Modernus
Skysčių chromatografo kintamoji siurbimo sistema susideda iš vieno ar daugiau siurblių, valdomų kompiuteriu. Tai leidžia jums pakeisti
tampa PF pagal specialią programą su gradiento eliuavimu. Sme-
PF komponentai maišytuve gali maišytis tiek esant žemam slėgiui
jonų (prieš siurblius) ir esant aukštam slėgiui (po siurblių). Maišytuvas gali būti naudojamas PF paruošimui ir izokratiniam eliuavimui,
tačiau tikslesnis komponentų santykis pasiekiamas preliminariai
PF komponentų maišymas izokratiniam procesui. Analitiniai HPLC siurbliai leidžia palaikyti pastovų PF srautą į kolonėlę nuo 0,1 iki 10 ml/min, kai kolonėlės įėjimo slėgis yra iki 50 MPa. Tačiau patartina, kad ši vertė neviršytų
20 MPa. Slėgio pulsacijos sumažinamos specialiu slopinimu
antgalių sistemos, įtrauktos į siurblių konstrukciją. Darbo dalys -
siurbliai pagaminti iš korozijai atsparių medžiagų, todėl PF sudėtyje galima naudoti agresyvius komponentus.
Maišytuvai
Pagal konstrukciją maišytuvai gali būti statiniai arba dinamiški.
mikrofonas.
Maišytuve viena judri fazė susidaro iš
specifiniai tirpikliai, tiekiami siurbliais, jei reikiamas mišinys nebuvo paruoštas iš anksto. Tirpiklių maišymas dažniausiai vyksta savaime, tačiau kartais naudojamos sistemos su priverstiniu maišymu.
siuvimas.
Purkštukai
Injektoriai gali būti universalūs mėginiams įvesti iš
Nuo 1 µl iki 2 ml arba atskirai, jei mėginys įšvirkščiamas tik tam tikro tūrio
ema. Abu purkštukų tipai gali būti automatiniai („automatiniai purkštukai“ arba „automatiniai mėginių ėmikliai“). Injektorius mėginiui (tirpalui) įvesti yra ne -
prieš pat chromatografinę kolonėlę. Injektoriaus konstrukcija leidžia keisti PF srauto kryptį ir preliminariai įvesti mėginį į tam tikro tūrio kilpą (dažniausiai nuo 10 iki 100 μl).
Šis tūris nurodytas kilpos etiketėje. Injektoriaus konstrukcija leidžia pakeisti kilpą. Įvesti analizuojamą tirpalą į ne av.
Tomatinis injektorius naudoja rankinį mikrošvirkštą, kurio tūris yra reikšmingas
gerokai viršijantis kilpos tūrį. Suleisto tirpalo perteklius, ne
kilpoje yra išmetamas ir į kolonėlę įpurškiamas tikslus ir visada toks pat mėginio tūris. Rankinis nepilnas kilpos užpildymas sumažina tikslumą
dozavimo tikslumas ir atkuriamumas ir dėl to pablogėja tikslumas
ir chromatografinės analizės atkuriamumas.
Chromatografijos kolonėlė
Chromatografinės kolonėlės dažniausiai yra nerūdijančio plieno, stiklo arba plastiko vamzdeliai, užpildyti sorbentu ir uždaryti.
iš abiejų pusių su filtrais, kurių porų skersmuo 2–5 µm. Analizės trukmė
kolonėlė, priklausomai nuo chromatografinio atskyrimo mechanizmo, gali būti nuo 5 iki 60 cm ar daugiau (dažniausiai tai yra
10-25 cm), vidinis skersmuo - nuo 2 iki 10 mm (dažniausiai 4,6 mm). Chromo mikrokolonėlėje naudojamos kolonėlės, kurių vidinis skersmuo mažesnis nei 2 mm
tografija. Taip pat naudojamos vidinio skersmens kapiliarinės kolonėlės.
romas apie 0,3-0,7 mm. Paruošiamosios chromatografijos kolonėlių vidinis skersmuo yra iki 50 mm arba didesnis.
Prieš analizinę kolonėlę galima įrengti trumpus kabelius.
kolonos (prieškolonos), atliekančios įvairias pagalbines funkcijas
(dažniau – analitinės kolonėlės apsauga). Paprastai analizė atliekama
kambario temperatūroje, tačiau siekiant padidinti atskyrimo efektyvumą ir
sutrumpinant analizės trukmę, galima naudoti termostatą
kolonų tirovaniye ne aukštesnėje kaip 60 C temperatūroje. Esant daugiau nei aukšta temperatūra galimas sorbento sunaikinimas ir PF sudėties pasikeitimas.
Stacionari fazė (sorbentas)
Dažniausiai naudojami sorbentai:
1. Įprastai naudojamas silikagelis, aliuminio oksidas, porėtas grafitas
mažos fazės chromatografija. Laikymo mechanizmas šiuo atveju
arbata – dažniausiai adsorbcija;
2. Dervos arba polimerai su rūgštinėmis arba bazinėmis grupėmis. Taikymo sritis – jonų mainų chromatografija;
3. Porėtas silikagelis arba polimerai (dydžio išskyrimo chromatografija);
4. Chemiškai modifikuoti sorbentai (sorbentai su skiepyta fa-
zami), dažniausiai ruošiamas silikagelio pagrindu. Išlaikymo mechanizmas daugeliu atvejų yra paskirstymas tarp mobiliųjų
nojaus ir nejudančios fazės;
5. Pavyzdžiui, chemiškai modifikuoti chiraliniai sorbentai,
vandeninės celiuliozės ir amilozės, baltymai ir peptidai, ciklodekstrinai,
naudojamas enantiomerams atskirti (chiralinė chromatografija)
Surištos fazės sorbentai gali turėti skirtingą cheminės medžiagos laipsnį
chesky modifikacija. Sorbento dalelės gali būti sferinės arba nesferinės.
taisyklinga forma ir įvairus poringumas.
Dažniausiai naudojamos surištos fazės:
– oktilo grupės(sorbentas oktilsilanas arba C8);
– oktadecilo grupės(sorbentas oktadecilsilanas
(ODS) arba C18);
– fenilo grupės(sorbentas fenilsilanas);
– cianopropilo grupės(sorbentas CN);
– aminopropilo grupės(NH2 sorbentas);
– diolių grupės (sorbentinis diolis).
Dažniausiai analizė atliekama nepolinėse surištose fazėse
atvirkštinės fazės režimas, naudojant sorbentą C18.
Kai kuriais atvejais tikslingiau naudoti įprastą
fazinė chromatografija. Šiuo atveju silikagelis arba polinės surištos fazės („CN“, „NH2“, „diolis“) naudojamos kartu su nepolinėmis tirpiosiomis medžiagomis.
Surištos fazės sorbentai yra chemiškai stabilūs esant pH vertėms nuo 2,0 iki 8,0, jei gamintojas nenurodo kitaip.
Sorbento dalelės gali būti sferinės arba netaisyklingos formos ir įvairaus poringumo. Analitinio HPLC sorbento dalelių dydis paprastai yra 3–10 µm, preparatiniame HPLC – iki 50 µm ar daugiau.
Taip pat naudojami monolitiniai sorbentai.
Aukštą atskyrimo efektyvumą užtikrina didelis sorbento dalelių paviršiaus plotas (tai yra jų mikroskopijos pasekmė).
porų buvimas), taip pat sorbento sudėties vienodumas ir tankus bei vienodas įpakavimas.
Detektoriai
Naudojami įvairūs aptikimo metodai. Bendruoju atveju PF su jame ištirpusiais komponentais po chromatografinės kolonėlės
ki patenka į detektoriaus kamerą, kur nuolat matuojamos vienos ar kitos jo savybės (absorbcija UV arba matomoje spektro srityje, fluorescencija,
lūžio rodiklis, elektrinis laidumas ir kt.). Gauta chromatograma yra tam tikros fizikinės priklausomybės grafikas
arba PF fizikinį ir cheminį parametrą laiku.
Labiausiai paplitę yra spektrofotometriniai
detektoriai (įskaitant diodų matricą), registruojantys optinio pakeitimą
tankis ultravioletiniuose, matomuose ir dažnai artimuosiuose infraraudonuosiuose spinduliuose
kitose spektro srityse nuo 190 iki 800 arba 900 nm. Šiuo atveju chromatograma
arbata yra PF optinio tankio priklausomybė nuo laiko.
Tradiciškai naudojamas spektrofotometrinis detektorius leidžia
leidžia aptikti bet kurio bangos ilgio veikimo diapazone
zona. Taip pat naudojami daugiabangiai detektoriai, leidžiantys laidumą
atlikti aptikimą keliuose bangos ilgiuose vienu metu.
Diodų matricos detektoriaus pagalba galima ne tik aptikti kelis bangos ilgius vienu metu, bet ir beveik akimirksniu.
bet kuriuo metu galima (be skenavimo) gauti PF optinį spektrą, o tai labai supaprastina atskirtų komponentų kokybinę analizę
komponentai.
Fluorescencinių detektorių jautrumas yra maždaug 1000 kartų didesnis nei spektrofotometrinių. Šiuo atveju naudojama arba jos pačios fluorescencija, arba atitinkamų darinių fluorescencija, jei pati analitė nefluorescuoja. Modernus
Keičiami fluorescenciniai detektoriai leidžia ne tik gauti chromato-
gramų, bet ir užregistruoti analizės sužadinimo ir fluorescencijos spektrus.
sunkūs ryšiai.
Refraktometriniai detektoriai naudojami mėginiams, kurie nesugeria UV spindulių ir matomose spektro srityse (pavyzdžiui, angliavandenių), analizuoti.
(refraktometrai). Šių detektorių trūkumai – mažas (palyginti su spektrofotometriniais detektoriais) jautrumas ir reikšminga signalo intensyvumo priklausomybė nuo temperatūros (detektorius turi būti termostatuotas).
Taip pat naudojami elektrocheminiai detektoriai (konduktometriniai
dangus, amperometrinis ir kt.), masių spektrometrinis ir Furjė IR
detektoriai, šviesos sklaidos, radioaktyvumo detektoriai ir kai kurie kiti
mobilioji fazė
AT Kaip PF gali būti naudojami įvairūs tirpikliai – tiek pavieniai, tiek jų mišiniai.
AT normalios fazės Chromatografijoje dažniausiai naudojama skystoji anglis
angliavandeniliai (heksanas, cikloheksanas, heptanas) ir kiti santykinai nepoliniai
tirpikliai su nedideliais polinių organinių junginių priedais,
kurios reguliuoja PF eliuavimo stiprumą.
Atvirkštinės fazės chromatografijoje PF sudėtis apima polinius arba
organiniai tirpikliai (dažniausiai acetonitrilas ir metanolis) ir vanduo. Dėl optimizavimo -
Atskyrimo tyrimuose dažnai naudojami vandeniniai tirpalai su tam tikru ženklu
pH vertė, ypač buferiniai tirpalai. Naudojami neorganiniai priedai
kalio ir organinės rūgštys, bazės ir druskos bei kiti junginiai (ant
Pavyzdžiui, chiraliniai modifikatoriai enantiomerams atskirti į achiralinius
nom sorbentas).
PH vertės kontrolė turi būti atliekama atskirai vandeniniam komponentui, o ne jo mišiniui su organiniu tirpikliu.
PF gali sudaryti vienas tirpiklis, dažnai du, jei reikia
mažumas - nuo trijų ar daugiau. PF sudėtis nurodoma kaip jį sudarančių tirpiklių tūrio santykis. Kai kuriais atvejais masė
santykis, kuris turi būti specialiai nustatytas.
Naudojant UV spektrofotometrinį detektorių, PF neturėtų turėti ryškios sugerties esant pasirinktam aptikimui bangos ilgiui. Skaidrumo arba optinio tankio riba nustatant
dažnai nurodomas nurodytas konkretaus gamintojo tirpiklio bangos ilgis
yra ant pakuotės.
Chromatografinei analizei didelę įtaką daro PF grynumo laipsnis, todėl geriau naudoti pagamintus tirpiklius.
nye specialiai skysčių chromatografijai (įskaitant vandenį).
PF ir analizuojamuose tirpaluose neturi būti neištirpusių medžiagų
dalelių ir dujų burbuliukų. Vanduo, gautas laboratorijoje
vandeniniai tirpalai, iš anksto sumaišyti su vandens organiniais tirpikliais
Tirpikliai ir analizuojami tirpalai turi būti kruopščiai filtruojami ir degazuojami. Šiuo tikslu dažniausiai naudojamas filtravimas.
vakuume per membraninį filtrą, inertišką šio tirpiklio ar tirpalo atžvilgiu, kurio porų dydis 0,45 μm.
Duomenų rinkimo ir apdorojimo sistema
Šiuolaikinė duomenų apdorojimo sistema yra konjuguota
asmeninis kompiuteris, prijungtas prie chromatografo ir įdiegta programinė įranga
programinė įranga, leidžianti registruoti ir apdoroti chrono
matogramą, taip pat valdyti chromatografo darbą ir stebėti pagrindinį
mi chromatografinės sistemos parametrus.
Chromatografinių sąlygų sąrašas, kurį reikia nurodyti
Privačioje monografijoje bendrai matmenys
kolonėlės, sorbento tipas, nurodant dalelių dydį, kolonėlės temperatūrą (jei reikia kontroliuoti temperatūrą), įpurškto mėginio tūris (kilpos tūris),
PF būsena ir jo paruošimo būdas, PF padavimo greitis, detektorius ir aptikimo sąlygos, gradiento režimo aprašymas (jei naudojamas), chromatografijos laikas.
JONŲ MAINAI IR JONŲ HPLC
Jonų mainų chromatografija naudojama analizei kaip organinė medžiaga
skikh (heterociklinės bazės, aminorūgštys, baltymai ir kt.) ir ne arba-
ganiniai (įvairūs katijonai ir anijonai) junginiai. Komponentų atskyrimas
jonų mainų chromatografijoje analizuojamo mišinio komponentai grindžiami grįžtamąja analizuojamų medžiagų jonų sąveika su joninėmis grupėmis.
pami sorbentas. Kaip sorbentai naudojami anijonų arba katijonų keitikliai.
tu. Šie sorbentai daugiausia yra polimeriniai jonai.
mainų dervos (dažniausiai stireno ir divinilbenzeno kopolimerai su skiepais
joninės grupės) arba silikageliai su skiepytomis jonų mainų grupėmis. Anijonams atskirti naudojami sorbentai su -(CH2)3 N+ X– grupėmis, o katijonams – sorbentai su -(CH2)SO3 – H+ grupėmis.
Paprastai polimerinės dervos naudojamos anijonams atskirti ir el.
katijonai yra modifikuoti silikageliai.
Kaip PF jonų mainų chromatografijoje, naudojami vandeniniai rūgščių, bazių ir druskų tirpalai. Paprastai naudojamos buferinės lenktynės
tirpalai, leidžiantys išlaikyti tam tikras pH vertes. Taip pat galima naudoti nedidelius su vandeniu besimaišančių organinių medžiagų priedus
kal. tirpikliai – acetonitrilas, metanolis, etanolis, tetrahidrofuranas.
Jonų chromatografija- jonų mainų chromatografijos variantas, in
kuris naudojamas analitės jonų koncentracijai nustatyti
naudojant konduktometrinį detektorių. Labai jautriems op.
Norint nustatyti elektros laidumo, praeinančio per PF detektorių, pokyčius, PF foninis elektrinis laidumas turi būti mažas.
Yra du pagrindiniai jonų chromatografijos variantai.
Pirmasis iš jų yra pagrįstas elektrolito elektrinio laidumo slopinimu
kad PF naudojant antrąją jonų mainų kolonėlę, esančią tarp analinio
litinė kolonėlė ir detektorius. Šiame stulpelyje vyksta neutralizavimas
PF ir analizuojami junginiai patenka į detektoriaus ląstelę dejonizacijos metu
zirovannoy vandens. Aptikti jonai yra vieninteliai jonai
užtikrinant PF laidumą. Slopintuvo kolonėlės trūkumas yra būtinybė ją regeneruoti gana trumpais intervalais.
aš. Slopinimo kolonėlę galima pakeisti nuolat veikiančia
membranos slopintuvas, kuriame membranos sudėtis yra nuolat
yra regeneruojančio tirpalo srautas, judantis kryptimi
priešinga PF srauto krypčiai.
Antroji jonų chromatografijos versija yra vienos kolonėlės jonų chromatografija.
matografija. Šiame variante naudojamas labai mažo elektros laidumo PF.
vandens Turinys. Silpni organiniai junginiai plačiai naudojami kaip elektrolitai.
dangaus rūgštys – benzenkarboksirūgštis, salicilo arba izoftalio rūgštis.
DYDŽIO HPLC
Dydžio išskyrimo chromatografija (gelio chromatografija) yra speciali HPLC versija, pagrįsta molekulių atskyrimu pagal jų dydį. Paskirstymas
molekulės tarp stacionarios ir judriosios fazės yra pagrįstas mo-
molekulių ir iš dalies jų formos bei poliškumo. Atskyrimui naudokite
porėti sorbentai – polimerai, silikagelis, porėti stiklai ir polisacharidai.
Sorbentų dalelių dydis yra 5–10 µm.
Akytų stiklų ir silikagelio privalumai – greita PF ir analitės molekulių difuzija į poras, stabilumas įvairiomis sąlygomis (net esant aukštai temperatūrai). polimerinis sorbenas-
jūs esate stireno ir divinilbenzeno kopolimerai (tai yra hidro-
fobiniai sorbentai, naudojami su nepolinėmis judriomis fazėmis) ir
hidrofiliniai geliai, gauti iš sulfonuotų divinilbenzeno arba poliakrilamido dervų.
Galimi du ribojantys molekulių sąveikos su akyta stacionari faze tipai. Didesnės nei vidutinis poros skersmuo molekulės į sorbentą visiškai neįsiskverbia ir eliuuojamos kartu su judriąja faze.
pirmas zojus. Molekulės, kurių skersmuo daug mažesnis nei rūšies porų dydis
įlinkiai laisvai prasiskverbia į jį, ilgiausiai išlieka nejudančioje fazėje ir išsivalo paskutiniai. Vidutinio dydžio molekulės prasiskverbia į sorbento poras priklausomai nuo jų dydžio ir iš dalies priklausomai nuo jų formos. Jie išsiskiria skirtingu sulaikymo laiku tarp
mūsų didžiausios ir mažiausios molekulės. Chromatografinio mėginio komponentai atsiskiria dėl kartotinių
mėginio komponentų difuzija į sorbento poras ir atvirkščiai.
Dydžio išskyrimo chromatografijoje, siekiant apibūdinti sulaikymą,
naudojamas sulaikymo tūris, lygus PF srauto greičio ir sulaikymo trukmės sandaugai.
mobilioji fazė. PF pasirinkimas priklauso nuo sorbento tipo. Išskyrimas –
chromatografija paprastai skirstoma į gelio filtravimą ir gelio chromatografiją.
prasiskverbimo chromatografija.
Atskyrimui naudojamas gelio filtravimo chromatografijos metodas
vandenyje tirpių junginių ant hidrofilinių sorbentų. Judančios fazės yra vandeniniai buferiniai tirpalai, turintys tam tikrą pH vertę.
Gelio pralaidumo chromatografijoje naudojama hidrofobinė
sulenkimai ir nepoliniai organiniai tirpikliai (toluenas, dichlormetanas, tetra-
hidrofuranas). Šis metodas naudojamas mažai tirpiems junginiams analizuoti
įmerktas į vandenį.
Detektoriai. Kaip dydžio išskyrimo chromatografijos detektoriai naudojami diferencialiniai refraktometriniai detektoriai, taip pat spektrofotometriniai detektoriai (įskaitant tuos, kurie yra IR spektro srityje).
Taip pat naudojami viskozimetriniai ir srauto lazeriniai detektoriai.
Šie detektoriai, kartu su refraktometru ar kita koncentracija
detektorius leidžia nuolat nustatyti molekulinė masėį-
kalkinimas PF.
Ypatingo veikimo skysčių CHROMATOGRAFIJA
Itin efektyvi skysčių chromatografija yra efektyvesnis skysčių chromatografijos variantas
stu, palyginti su klasikiniu HPLC.
Ypatinga itin efektyvios skysčių chromatografijos savybė yra
sorbentų, kurių dalelių dydis yra nuo 1,5 iki 2 mikronų, naudojimas. Chro-
matografinės kolonos paprastai yra 50–150 mm ilgio ir 1
iki 4 mm skersmens. Suleidžiamo mėginio tūris gali būti nuo 1 iki 50 µl.
Chromatografinė įranga, naudojama klasikinėje
riante HPLC, paprastai specialiai pritaikytas tokio tipo chromatografijai
Įranga, sukurta itin efektyviai skysčių chromatografijai, taip pat gali būti naudojama klasikinėje HPLC versijoje.
BENDRASIS FARMAKOPĖJOS ĮGAIDIMAS
Vietoj str. GF XI
Didelio efektyvumo skysčių chromatografija (aukšto slėgio skysčių chromatografija) – tai kolonėlės chromatografijos metodas, kai judanti fazė yra skystis, judantis per chromatografinę kolonėlę, užpildytą stacionaria faze (sorbentu). Aukštos kokybės skysčių chromatografijos kolonėlės pasižymi dideliu hidrauliniu pasipriešinimu įleidimo angoje.
Atsižvelgiant į medžiagų atskyrimo mechanizmą, išskiriami šie didelio efektyvumo skysčių chromatografijos variantai: adsorbcija, pasiskirstymas, jonų mainai, išskyrimas, chiralinis ir kt., atsižvelgiant į pagrindinių pasireiškiančių tarpmolekulinių sąveikų pobūdį. Adsorbcinėje chromatografijoje medžiagos atsiskiria dėl skirtingo jų gebėjimo adsorbuotis ir desorbuotis nuo sorbento su išvystytu paviršiumi, pavyzdžiui, silikagelio, paviršiaus. Atliekant padalijimo efektyviąją skysčių chromatografiją, atskyrimas įvyksta dėl atskirtinų medžiagų pasiskirstymo koeficientų skirtumo tarp stacionarios (paprastai chemiškai įskiepytos ant stacionarios nešiklio paviršiaus) ir judriosios fazės.
Priklausomai nuo judriosios ir stacionarios fazės tipo, išskiriama normalios fazės ir atvirkštinės fazės chromatografija. Atliekant normalios fazės efektyviąją skysčių chromatografiją, stacionari fazė yra polinė (dažniausiai silikagelis arba silikagelis su skiepytomis NH 2 - arba CN grupėmis ir kt.), o judrioji fazė yra nepolinė (heksanas arba jų mišiniai). heksanas su poliškesniais organiniais tirpikliais – chloroformu, alkoholiais ir kt.). Medžiagų sulaikymas didėja didėjant poliškumui. Normalios fazės chromatografijoje judriosios fazės eliuavimo galia didėja didėjant poliškumui.
Atvirkštinės fazės chromatografijoje stacionari fazė yra nepolinė (hidrofobiniai silikageliai su skiepytomis C4, C8, C18 grupėmis ir kt.); judrioji fazė yra polinė (vandens ir polinių tirpiklių mišiniai: acetonitrilas, metanolis, tetrahidrofuranas ir kt.). Medžiagų sulaikymas didėja didėjant jų hidrofobiškumui (nepoliškumui). Kuo didesnis organinio tirpiklio kiekis, tuo didesnė judriosios fazės eliuavimo galia.
Atliekant jonų mainų chromatografiją, medžiagų mišinio molekulės, ištirpusios tirpale į katijonus ir anijonus, yra atskiriamos judant per sorbentą (katijonų keitiklį arba anijonų keitiklį) dėl skirtingų nustatomų jonų ir jonų sąveikos jėgų. sorbento grupės.
Dydžio išskyrimo (sieto, gelinio filtravimo) chromatografijoje medžiagų molekulės yra atskiriamos pagal dydį dėl skirtingo gebėjimo prasiskverbti į stacionarios fazės poras. Tokiu atveju didžiausios molekulės, galinčios prasiskverbti į minimalų stacionarios fazės porų skaičių, išeina iš kolonėlės pirmosios, o mažo molekulinio dydžio medžiagos – paskutinės.
Chiralinėje chromatografijoje optiškai aktyvūs junginiai yra atskiriami į atskirus enantiomerus. Atskyrimas gali būti atliekamas chiralinėse stacionariose fazėse arba achiralinėse stacionariose fazėse, naudojant chiralines judančias fazes.
Yra ir kitų didelio efektyvumo skysčių chromatografijos variantų.
dažnai atskyrimas vyksta ne vienu, o keliais mechanizmais vienu metu, priklausomai nuo judrios ir stacionarios fazės tipo, taip pat nuo nustatomo junginio pobūdžio.
Taikymo sritis
Didelio efektyvumo skysčių chromatografija sėkmingai naudojama tiek kokybinei, tiek kiekybinei vaistų analizei atliekant tyrimus „Tapatybė“, „Svetimos priemaišos“, „Tirpumas“, „Dozavimo vienodumas“, „Kiekybinis nustatymas“. Reikėtų pažymėti, kad chromatografija leidžia sujungti kelis tyrimus viename mėginyje, įskaitant "tapatybę" ir "kiekybinį nustatymą".
Įranga
Analizei naudojami atitinkami instrumentai – skysčių chromatografai.
Skysčių chromatografo sudėtį paprastai sudaro šie pagrindiniai komponentai:
- judriosios fazės paruošimo įrenginys, įskaitant talpyklą su judančia faze (arba talpyklas su atskirais tirpikliais, kurie yra judriosios fazės dalis) ir judriosios fazės degazavimo sistemą;
- siurbimo sistema;
– mobiliosios fazės maišytuvas (jei reikia);
– mėginių įpurškimo sistema (injektorius), gali būti rankinė arba automatinė (autosampler);
— chromatografinė kolonėlė (galima montuoti termostate);
— detektorius (vienas ar daugiau su skirtingais aptikimo metodais);
— chromatografo valdymo sistema, duomenų rinkimas ir apdorojimas.
Be to, chromatografe gali būti: mėginių paruošimo sistema ir prieškoloninis reaktorius, kolonėlės perjungimo sistema, reaktorius po kolonėlės ir kita įranga.
Siurbimo sistema
Siurbliai tiekia mobiliąją fazę į kolonėlę iš anksto nustatytu greičiu. Judančios fazės sudėtis ir srautas gali būti pastovūs arba keisti analizės metu. Jei judrioji fazė yra pastovi, procesas vadinamas izokratišku, o antruoju - gradientu. Šiuolaikinė skysčių chromatografo siurbimo sistema susideda iš vieno ar kelių kompiuteriu valdomų siurblių. Tai leidžia keisti judriosios fazės sudėtį pagal specialią programą gradiento eliuavimo metu. Analitiniai didelio efektyvumo skysčių chromatografijos siurbliai leidžia palaikyti judriosios fazės srautą į kolonėlę nuo 0,1 iki 10 ml/min, kai kolonėlės įėjimo slėgis yra iki 40 MPa. Slėgio pulsacijas sumažina specialios slopintuvų sistemos, įtrauktos į siurblių konstrukciją. Siurblių darbinės dalys pagamintos iš korozijai atsparių medžiagų, todėl mobiliosios fazės sudėtyje gali būti naudojami agresyvūs komponentai.
Maišytuvai
Maišytuve iš atskirų siurblių tiekiamų tirpiklių susidaro viena judri fazė, jei reikiamas mišinys nebuvo paruoštas iš anksto. Judančios fazės komponentų maišymas maišytuve gali vykti tiek esant žemam slėgiui (prieš siurblius), tiek esant aukštam slėgiui (po siurblių). Maišytuvas gali būti naudojamas mobiliosios fazės paruošimui ir izokratiniam eliuavimui.
Maišytuvo tūris gali turėti įtakos komponentų sulaikymo laikui gradientiniame eliuavime.
Purkštukai
Injektoriai gali būti universalūs, su galimybe keisti įšvirkščiamo mėginio tūrį, arba diskretūs, skirti tik tam tikro tūrio mėginiui įvesti. Abu purkštukų tipai gali būti automatiniai („automatiniai purkštukai“ arba „automatiniai mėginių ėmikliai“). Mėginio injektorius (tirpalas) yra tiesiai priešais chromatografinę kolonėlę. Injektoriaus konstrukcija leidžia keisti judriosios fazės tekėjimo kryptį ir preliminariai įvesti mėginį į tam tikro tūrio (dažniausiai nuo 10 iki 100 μl) dozavimo kilpą arba į specialų kintamo tūrio dozavimo įrenginį. Kilpos tūris nurodytas ant jo žymėjimo. Diskretaus purkštuko konstrukcija, kaip taisyklė, leidžia pakeisti kilpą. Šiuolaikiniai automatiniai purkštukai gali turėti daugybę papildomos funkcijos, pavyzdžiui, atlikti mėginių paruošimo stoties funkciją: maišyti ir atskiesti mėginius, atlikti prieškoloninę derivatizacijos reakciją.
Chromatografijos kolonėlė
Chromatografinės kolonėlės dažniausiai yra nerūdijančio plieno, stiklo arba plastiko vamzdeliai, užpildyti sorbentu ir iš abiejų pusių uždaryti filtrais, kurių porų skersmuo 2–5 µm. Analitinės kolonėlės ilgis gali būti nuo 5 iki 60 cm ar daugiau, vidinis skersmuo – nuo 2 iki 10 mm. Mikrokolonėlių chromatografijoje naudojamos kolonėlės, kurių vidinis skersmuo mažesnis nei 2 mm. Taip pat yra kapiliarinių kolonų, kurių vidinis skersmuo yra apie 0,3–0,7 mm. Paruošiamosios chromatografijos kolonėlių vidinis skersmuo gali būti 50 mm ar didesnis.
Prieš analizinę kolonėlę gali būti sumontuotos trumpos kolonėlės (prieškolonės), kurios atlieka įvairias pagalbines funkcijas, kurių pagrindinė yra analitinės kolonėlės apsauga. Paprastai analizė atliekama kambario temperatūroje, tačiau norint padidinti atskyrimo efektyvumą ir sutrumpinti analizės trukmę, gali būti naudojamas kolonėlių termoreguliavimas iki 80–100 °C temperatūroje. Galimybę naudoti padidintą temperatūrą atskyrimo metu riboja stacionarios fazės stabilumas, nes ją galima sunaikinti esant aukštesnei temperatūrai.
Stacionari fazė (sorbentas)
Dažniausiai naudojami sorbentai:
- silikagelis, aliuminio oksidas, naudojami normalios fazės chromatografijoje. Sulaikymo mechanizmas šiuo atveju dažniausiai yra adsorbcija;
- silikagelis, dervos arba polimerai su skiepytomis rūgštinėmis arba bazinėmis grupėmis. Taikymo sritis – jonų mainai ir jonų chromatografija;
- silikagelis arba polimerai su tam tikru porų dydžio pasiskirstymu (dydžio išskyrimo chromatografija);
- chemiškai modifikuoti sorbentai (surištos fazės sorbentai), dažniausiai ruošiami silikagelio pagrindu. Sulaikymo mechanizmas yra adsorbcija arba pasiskirstymas tarp mobiliosios ir stacionarios fazės. Taikymo sritis priklauso nuo skiepytų funkcinių grupių tipo. Kai kurių tipų sorbentai gali būti naudojami tiek atvirkštinės, tiek normaliosios fazės chromatografijoje;
- chemiškai modifikuoti chiraliniai sorbentai, pavyzdžiui, celiuliozės ir amilozės dariniai, baltymai ir peptidai, ciklodekstrinai, chitozanai, naudojami enantiomerams atskirti (chiralinė chromatografija).
Surištos fazės sorbentai gali turėti skirtingą cheminės modifikacijos laipsnį. Dažniausiai naudojamos surištos fazės:
– oktadecilo grupės (sorbentas oktadecilsilanas (ODS) arba C 18);
– oktilo grupės (sorbentas oktilsilanas arba C 8);
– fenilo grupės (fenilsilano sorbentas);
– cianopropilo grupės (CN sorbentas);
– aminopropilo grupės (NH 2 sorbentas);
– diolių grupės (sorbentinis diolis).
Dažniausiai analizė atliekama nepolinėse surištose fazėse atvirkštinės fazės režimu, naudojant C 18 sorbentą.
Surištos fazės sorbentai silikagelio pagrindu yra chemiškai stabilūs esant pH vertėms nuo 2,0 iki 7,0, jei gamintojas nenurodo kitaip. Sorbento dalelės gali būti sferinės arba netaisyklingos formos ir įvairaus poringumo. Analitinėje didelio efektyvumo skysčių chromatografijoje sorbento dalelių dydis paprastai yra 3–10 µm, preparatinėje didelio efektyvumo skysčių chromatografijoje – 50 µm ar daugiau. Taip pat yra monolitinių kolonėlių, kuriose sorbentas yra monolitas su perporomis, užpildantis visą kolonėlės tūrį.
Aukštą atskyrimo efektyvumą užtikrina didelis sorbento dalelių paviršiaus plotas (tai yra jų mikroskopinio dydžio ir porų buvimo pasekmė), taip pat sorbento sudėties vienodumas ir tankus bei vienodas įpakavimas.
Detektoriai
Didelio efektyvumo skysčių chromatografijoje naudojami įvairūs aptikimo metodai. Bendruoju atveju judrioji fazė su joje ištirpusiais komponentais po chromatografinės kolonėlės patenka į detektoriaus kamerą, kur nuolat matuojamos vienos ar kitos jos savybės (absorbcija ultravioletinėje arba matomoje spektro srityje, fluorescencija, lūžio rodiklis, fluorescencija ir kt. elektros laidumas ir kt.). Gauta chromatograma yra judriosios fazės kai kurių fizikinių ar fizikinių-cheminių parametrų priklausomybės nuo laiko grafikas.
Labiausiai paplitę didelio efektyvumo skysčių chromatografijos detektoriai yra spektrofotometriniai. Medžiagų eliuavimo metu specialiai suprojektuotame mikroelemente matuojamas eliuato optinis tankis esant iš anksto pasirinktam bangos ilgiui. Platus detektoriaus tiesiškumo diapazonas leidžia vienoje chromatogramoje analizuoti tiek priemaišas, tiek pagrindinius mišinio komponentus. Spektrofotometrinis detektorius leidžia aptikti bet kokį bangos ilgį jo veikimo diapazone (paprastai 190–600 nm). Taip pat naudojami daugiabangiai detektoriai, kurie leidžia aptikti kelis bangos ilgius vienu metu, ir diodų matricos detektoriai, leidžiantys vienu metu įrašyti optinį tankį visame veikimo bangų ilgių diapazone (dažniausiai 190–950 nm). Tai leidžia įrašyti komponentų, einančių per detektoriaus elementą, sugerties spektrus.
Fluorimetrinis detektorius naudojamas aptikti fluorescencinius junginius arba nefluorescuojančius junginius jų fluorescencinių darinių pavidalu. Fluorimetrinio detektoriaus veikimo principas pagrįstas sugertos šviesos fluorescencinės emisijos matavimu. Sugertis dažniausiai atliekama ultravioletinėje spektro srityje, fluorescencinės spinduliuotės bangos ilgiai viršija sugertos šviesos bangos ilgius. Fluorometriniai detektoriai turi labai didelį jautrumą ir selektyvumą. Fluorescencinių detektorių jautrumas yra maždaug 1000 kartų didesnis nei spektrofotometrinių. Šiuolaikiniai fluorescenciniai detektoriai leidžia ne tik gauti chromatogramas, bet ir fiksuoti analizuojamų junginių sužadinimo ir fluorescencijos spektrus.
Norėdami nustatyti junginius, kurie silpnai sugeria ultravioletinę ir matomą spektro sritį (pavyzdžiui, angliavandenius), naudokite refraktometrinis detektoriai (refraktometrai). Šių detektorių trūkumai – mažas (palyginti su spektrofotometriniais detektoriais) jautrumas ir reikšminga signalo intensyvumo priklausomybė nuo temperatūros (detektorius turi būti termostatuotas), taip pat negalėjimas juos naudoti gradiento eliuavimo režimu.
Veikimo principas garavimo lazeriniai šviesos sklaidos detektoriai yra pagrįstas chromatografinių tirpiklių, sudarančių judriąją fazę, ir analizuojamų medžiagų garų slėgių skirtumu. Judanti fazė kolonėlės išėjimo angoje įvedama į purkštuvą, sumaišoma su azotu arba CO 2 ir smulkiai dispersinio aerozolio pavidalu patenka į šildomą 30–160 °C temperatūros garintuvo vamzdelį, kuriame judrioji fazė išgaruoja. Nelakių analizuojamų medžiagų dalelių aerozolis išsklaido šviesos srautą dispersijos kameroje. Pagal šviesos srauto sklaidos laipsnį galima spręsti apie nustatyto junginio kiekį. Detektorius yra jautresnis nei refraktometrinis, jo signalas nepriklauso nuo mėginio optinių savybių, nuo funkcinių grupių tipo analitėse, nuo judriosios fazės sudėties ir gali būti naudojamas gradiento eliuavimo režimu. .
Elektrocheminiai detektoriai (kondukometriniai, amperometriniai, kulonometriniai ir kt.). Amperometrinis detektorius naudojamas aptikti elektroaktyvius junginius, kurie gali oksiduotis arba redukuotis ant kieto elektrodo paviršiaus. Analitinis signalas yra oksidacijos arba redukcijos srovės dydis. Detektoriaus elementas turi mažiausiai du elektrodus – darbinį elektrodą ir etaloninį elektrodą (sidabro chlorido arba plieno). Elektrodams taikomas darbinis potencialas, kurio reikšmė priklauso nuo nustatomų junginių pobūdžio. Matavimai gali būti atliekami tiek esant pastoviam potencialui, tiek impulsiniu režimu, kai vieno signalo įrašymo ciklo metu nustatomas darbinio elektrodo potencialo kitimo profilis. Amperometriniame detektoriuje naudojami darbiniai elektrodai iš anglies medžiagų (dažniausiai stiklinės anglies arba grafito) ir metalo: platinos, aukso, vario, nikelio.
Konduktometrinis detektorius naudojamas anijonams ir katijonams aptikti jonų chromatografijoje. Jo veikimo principas pagrįstas judriosios fazės elektrinio laidumo matavimu medžiagos eliuavimo metu.
Išskirtinai informatyvus yra masių spektrometrinis detektorius, pasižymintis dideliu jautrumu ir selektyvumu. Naujausi masių spektrometrų modeliai, skirti skysčių chromatografijai, veikia m/z masės diapazone nuo 20 iki 4000 amu.
Didelio efektyvumo skysčių chromatografijoje taip pat naudojami Furjė IR detektoriai, radioaktyvumas ir kai kurie kiti.
Duomenų rinkimo ir apdorojimo sistema
Šiuolaikinė duomenų apdorojimo sistema – tai prie chromatografo prijungtas asmeninis kompiuteris su įdiegta programine įranga, leidžiančia registruoti ir apdoroti chromatogramą, taip pat valdyti chromatografo darbą ir stebėti pagrindinius chromatografinės sistemos parametrus.
mobilioji fazė
Mobilioji fazė didelio efektyvumo skysčių chromatografijoje atlieka dvejopą funkciją: užtikrina desorbuotų molekulių pernešimą išilgai kolonėlės ir reguliuoja pusiausvyros konstantas, taigi ir sulaikymą dėl sąveikos su stacionaria faze (sorbuojama ant paviršiaus). ) ir su atskirtų medžiagų molekulėmis. Taigi, pakeitus judriosios fazės sudėtį didelio efektyvumo skysčių chromatografijoje, galima daryti įtaką junginių sulaikymo laikui, jų atskyrimo selektyvumui ir efektyvumui.
Mobiliąją fazę gali sudaryti vienas tirpiklis, dažnai du, jei reikia, trys ar daugiau. Judančios fazės sudėtis nurodoma kaip ją sudarančių tirpiklių tūrio santykis. Kai kuriais atvejais gali būti nurodytas masės santykis, kuris turėtų būti specialiai nurodytas. Kaip judriosios fazės komponentai gali būti naudojami buferiniai tirpalai, turintys tam tikrą pH vertę, įvairios druskos, rūgštys ir bazės bei kiti modifikatoriai.
Normalios fazės chromatografijoje dažniausiai naudojami skysti angliavandeniliai (heksanas, cikloheksanas, heptanas) ir kiti santykinai nepoliniai tirpikliai su nedideliais polinių organinių junginių priedais, kurie kontroliuoja judriosios fazės eliuavimo stiprumą.
Atvirkštinės fazės chromatografijoje kaip judrioji fazė naudojamas vanduo arba vandeniniai-organiniai mišiniai. Organiniai priedai dažniausiai yra poliniai organiniai tirpikliai (acetonitrilas ir metanolis). Atskyrimui optimizuoti gali būti naudojami tam tikros pH vertės vandeniniai tirpalai, ypač buferiniai tirpalai, taip pat įvairūs judriosios fazės priedai: fosforo ir acto rūgštys atskiriant rūgštinius junginius; amoniakas ir alifatiniai aminai atskiriant bazinius junginius ir kiti modifikatoriai.
Mobiliosios fazės grynumas labai veikia chromatografinę analizę, todėl geriau naudoti specialiai skysčių chromatografijai išleistus tirpiklius (įskaitant vandenį).
Naudojant UV spektrofotometrinį detektorių, judrioji fazė neturėtų turėti ryškios sugerties, kai bangos ilgis pasirinktas aptikimui. Skaidrumo arba optinio tankio riba, esant tam tikram konkretaus gamintojo tirpiklio bangos ilgiui, dažnai nurodoma ant pakuotės.
Judančioje fazėje ir analizuojamuose tirpaluose neturi būti neištirpusių dalelių ir dujų burbuliukų. Laboratorinėmis sąlygomis gautas vanduo, vandeniniai tirpalai, organiniai tirpikliai, anksčiau sumaišyti su vandeniu, taip pat tirti tirpalai turi būti smulkiai filtruojami ir degazuojami. Šiems tikslams dažniausiai naudojamas vakuuminis filtravimas per membraninį filtrą, kurio porų dydis 0,45 μm, kuris yra inertiškas tam tikro tirpiklio ar tirpalo atžvilgiu.
Chromatografinių sąlygų sąrašas, kurį reikia nurodyti
Monografijoje turi būti: visas komercinis kolonėlės pavadinimas, nurodant gamintoją ir katalogo numerį, kolonėlės matmenys (ilgis ir vidinis skersmuo), sorbento tipas, nurodant dalelių dydį, porų dydį, kolonėlės temperatūrą (jei būtina temperatūros kontrolė), įšvirkšto mėginio tūris (tūrio kilpos), judriosios fazės sudėtis ir jo paruošimo būdas, judriosios fazės padavimo greitis, detektoriaus tipas ir aptikimo sąlygos (jei reikia, naudojamos detektoriaus kameros parametrai), gradiento režimo aprašymas (jei naudojamas) , įskaitant pradinių sąlygų atkūrimo etapą, chromatografijos laiką, Išsamus aprašymas metodai ir skaičiavimo formulės, etaloninių ir tiriamųjų tirpalų ruošimo aprašymai.
Jei automatiniame mėginių ėmimo įrenginyje naudojamas išvestis prieš stulpelį, pateikiama informacija apie automatinio mėginio ėmimo programą. Taikant derivatizaciją po kolonėlės, nurodomas derivatizuojančio reagento padavimo greitis, maišymo kilpos tūris ir jo temperatūra.
Modifikuota didelio efektyvumo skysčių chromatografija
Jonų porų chromatografija
Viena iš atvirkštinės fazės didelio efektyvumo skysčių chromatografijos atmainų yra jonų porų chromatografija – leidžianti nustatyti jonizuotus junginius. Norėdami tai padaryti, į tradicinę atvirkštinės fazės efektyvią skysčių chromatografiją judriojoje fazėje pridedami hidrofobiniai organiniai junginiai su jonogeninėmis grupėmis (jonų porų reagentai). Bazėms atskirti dažniausiai naudojami natrio alkilsulfatai, rūgštims atskirti – tetraalkilamonio druskos (tetrabutilamonio fosfatas, cetiltrimetilamonio bromidas ir kt.). Jonų poros režimu nejoninių komponentų atskyrimo selektyvumą ribos atvirkštinės fazės sulaikymo mechanizmas, o bazių ir rūgščių sulaikymas žymiai padidėja, o chromatografinių smailių forma pagerėja.
Išlaikymas jonų poros režime atsiranda dėl gana sudėtingų pusiausvyros procesų, kurie konkuruoja tarpusavyje. Viena vertus, dėl hidrofobinės sąveikos ir judriosios fazės polinės terpės poslinkio poveikio hidrofobinių jonų sorbcija ant alkilsilikagelio paviršiaus yra įmanoma taip, kad įkrautos grupės būtų nukreiptos į judriąją fazę. Tokiu atveju paviršius įgyja jonų mainų savybes, o sulaikymas paklūsta jonų mainų chromatografijos dėsniams. Kita vertus, jonų porą galima sudaryti tiesiogiai eliuento tūryje, o po to jį sorbuoti ant sorbento atvirkštinės fazės mechanizmu.
Hidrofilinės sąveikos chromatografija ( HILIC chromatografija)
Hidrofilinės sąveikos chromatografija naudojama atskirti polinius junginius, kurie prastai išlaikomi atvirkštinės fazės didelio efektyvumo skysčių chromatografijoje. Šiame chromatografijos variante kaip judrioji fazė naudojami vandens ir acetonitrilo mišiniai, pridedant druskų, rūgščių ar bazių. Stacionarios fazės, kaip taisyklė, yra silikageliai, modifikuoti polinėmis grupėmis (amino, diolio, cianopropilo grupėmis ir kt.). Daugiau polinių junginių laikomi stipresni. Judančios fazės eliuavimo galia didėja didėjant poliškumui.
Jonų mainų ir jonų didelio efektyvumo skysčių chromatografija
Jonų mainų chromatografija naudojama analizuoti tiek organinius (heterociklinės bazės, aminorūgštys, baltymai ir kt.), tiek neorganinius (įvairūs katijonai ir anijonai) junginius. Nagrinėjamo mišinio komponentų atskyrimas jonų mainų chromatografijoje pagrįstas grįžtamąja analizuojamų medžiagų jonų sąveika su sorbento jonų mainų grupėmis. Šie sorbentai daugiausia yra polimerinės jonų mainų dervos (dažniausiai stireno ir divinilbenzeno kopolimerai su skiepytomis jonų mainų grupėmis) arba silikageliai su skiepytomis jonų mainų grupėmis. Anijonams atskirti naudojami sorbentai su grupėmis: -NH 3 +, -R 3 N +, -R 2 HN +, -RH 2 N + ir kt., o sorbentai su grupėmis: -SO 3 -, - RSO 3 -, -COOH, -PO 3 - ir kiti, skirti katijonams atskirti (katijonaičiai).
Kaip judrioji fazė jonų mainų chromatografijoje naudojami vandeniniai rūgščių, bazių ir druskų tirpalai. Paprastai tam tikroms pH vertėms palaikyti naudojami buferiniai tirpalai. Taip pat galima naudoti nedidelius priedus su vandeniu besimaišančių organinių tirpiklių – acetonitrilo, metanolio, etanolio, tetrahidrofurano.
Jonų chromatografija - jonų mainų chromatografijos variantas, kai analitų (jonų) aptikimui naudojamas konduktometrinis detektorius. Norint labai jautriai nustatyti judriosios fazės, einančios per detektorių, laidumo pokyčius, judriosios fazės foninis laidumas turi būti mažas.
Yra du pagrindiniai jonų chromatografijos variantai.
Pirmoji iš jų, dviejų kolonėlių jonų chromatografija, pagrįsta judriosios fazės elektrolito elektrinio laidumo slopinimu, naudojant antrąją jonų mainų kolonėlę arba specialią membranos slopinimo sistemą, esančią tarp analitinės kolonėlės ir detektoriaus. Praeinant per sistemą, judriosios fazės elektrinis laidumas mažėja.
Antrasis jonų chromatografijos variantas yra vienos kolonėlės jonų chromatografija. Šiame variante naudojama labai mažo elektros laidumo judrioji fazė. Kaip elektrolitai plačiai naudojamos silpnos organinės rūgštys: benzenkarboksirūgštis, salicilo arba izoftalio rūgštis.
Išskirtinio dydžio didelio efektyvumo skysčių chromatografija
Dydžio išskyrimo chromatografija (gelio chromatografija) yra speciali didelio efektyvumo skysčių chromatografijos versija, pagrįsta molekulių atskyrimu pagal jų dydį. Molekulių pasiskirstymas tarp stacionarios ir judriosios fazės priklauso nuo molekulių dydžio ir iš dalies nuo jų formos bei poliškumo.
Galimi du ribojantys molekulių sąveikos su akyta stacionari faze tipai. Didesnės nei maksimalus porų skersmuo molekulės visiškai nepasilaiko ir pirmiausia išplaunamos, judėdamos kartu su judriąja faze. Molekulės, kurių dydis mažesnis už minimalų sorbento porų skersmenį, laisvai prasiskverbia į poras ir iš kolonėlės išplaunamos paskutinės. Likusios tarpinio dydžio molekulės iš dalies pasilieka porose ir eliuavimo metu suskirstomos į frakcijas pagal jų dydį ir iš dalies formą, priklausomai nuo dydžio ir iš dalies prasiskverbia į sorbento poras. , priklausomai nuo jų formos. Dėl to medžiagos eliuuojamos su skirtingu sulaikymo laiku.
Jonų išskyrimo chromatografija
Jonų išskyrimo chromatografijos mechanizmas pagrįstas poveikiu, dėl kurio jonizuotos formos junginiai nelieka ant jonų mainų sorbento, o molekulinės formos junginiai pasiskirsto tarp stacionarios ir vandeninės fazės porų viduje. jonų mainų sorbento ir judriosios fazės, migruojančios erdvėje tarp sorbento dalelių. Atskyrimas pagrįstas elektrostatiniu atstūmimu, poline ir hidrofobine sąveika tarp ištirpusių junginių ir sorbento.
Sorbento paviršiuje esančios anijoninės grupės veikia kaip pusiau pralaidi „membrana“ tarp stacionarios ir judriosios fazės. Neigiamai įkrauti komponentai nepasiekia stacionarios judriosios fazės, nes juos atstumia panašiai įkrautos funkcinės grupės ir eliuuojami „negyvame“ (laisvajame) kolonėlės tūryje. Molekulinės formos komponentai nėra „atmesti“ katijonų mainų sorbento ir pasiskirsto tarp stacionarios ir judriosios fazės. Mišinio nejoninių komponentų sulaikymo laipsnio skirtumą lemia nejoninių komponentų polinės sąveikos su katijonų mainų sorbento funkcinėmis grupėmis ir nejoninių komponentų hidrofobinės sąveikos su nejoniniais komponentais derinys. -polinė sorbentinė matrica.
Chiralinė chromatografija
Chiralinės chromatografijos tikslas yra atskirti optinius izomerus. Atskyrimas atliekamas chiralinėse stacionariose fazėse arba įprastose achiralinėse stacionariose fazėse, naudojant chiralines judančias fazes. Kaip chiralinės stacionarios fazės naudojami sorbentai su modifikuotu paviršiumi, grupės ar medžiagos, turinčios chiralinius centrus (chitozanas, ciklodekstrinai, polisacharidai, baltymai ir kt. (chiraliniai selektoriai). Šiuo atveju kaip judriosios fazės gali būti naudojamos tos pačios fazės kaip ir normalios fazės arba atvirkštinės fazės chromatografija.Naudojant achiralines stacionarias fazes enantiomerų atskyrimui užtikrinti, į judrias fazes dedama chiralinių modifikatorių: chiralinių metalų kompleksų, neutralių chiralinių ligandų, chiralinių jonų porų reagentų ir kt.
Itin efektyvi skysčių chromatografija
Itin efektyvi skysčių chromatografija yra skysčių chromatografijos variantas, kuris yra efektyvesnis už klasikinę didelio efektyvumo skysčių chromatografiją.
Itin efektyvios skysčių chromatografijos ypatybė yra sorbentų, kurių dalelių dydis yra nuo 1,5 iki 2 µm, naudojimas. Chromatografinės kolonėlės paprastai yra 50–150 mm ilgio ir 1–4 mm skersmens. Suleidžiamo mėginio tūris gali būti nuo 1 iki 50 µl. Tokių chromatografinių kolonėlių naudojimas gali žymiai sutrumpinti analizės laiką ir pagerinti chromatografinio atskyrimo efektyvumą. Tačiau tokiu atveju slėgis ant kolonėlės gali siekti 80–120 MPa, reikalingas detektoriaus duomenų rinkimo dažnis gali padidėti iki 40–100 Hz, o chromatografinės sistemos ekstrakolonėlės tūris turi būti sumažintas iki minimumo. Chromatografijos įranga ir kolonėlės, naudojamos itin efektyvioje skysčių chromatografijoje, yra specialiai pritaikytos šio tipo chromatografijos reikalavimams.
Įranga, sukurta itin efektyviai skysčių chromatografijai, taip pat gali būti naudojama klasikinėje didelio efektyvumo skysčių chromatografijoje.
Įvadas
Chromatografinė analizė yra medžiagos homogeniškumo kriterijus: jei analizuojama medžiaga nėra atskirta jokiu chromatografiniu metodu, tada ji laikoma vienalyte (be priemaišų).
Esminis skirtumas tarp chromatografinių metodų ir kitų fizikinių ir cheminių analizės metodų yra galimybė atskirti panašių savybių medžiagas. Atskyrus analizuojamo mišinio komponentus galima identifikuoti (nustatyti pobūdį) ir kiekybiškai įvertinti (masė, koncentracija) bet kokiais cheminiais, fiziniais ir fizikiniais bei cheminiais metodais.
Chromatografija plačiai naudojama laboratorijose ir pramonėje kokybinei ir kiekybinei daugiakomponentinių sistemų analizei, gamybos kontrolei, ypač susijusiai su daugelio procesų automatizavimu, taip pat atskirų medžiagų (pavyzdžiui, brangiųjų) preparatiniam (įskaitant pramoninį) išskyrimui. metalai), retų ir išsibarsčiusių elementų atskyrimas.
Pagal eliuento agregacijos būseną išskiriama dujų (GC, GC) ir skysčių chromatografija (HPLC, HPLC).
Aukštos kokybės skysčių chromatografija (HPLC, HPLC) naudojama sintetinių polimerų, vaistų, ploviklių, baltymų, hormonų ir kitų biologiškai svarbių junginių analizei, atskyrimui ir gryninimui. Naudojant itin jautrius detektorius, galima dirbti su labai mažais medžiagų kiekiais (10 -11 -10 -9 g), o tai itin svarbu biologiniuose tyrimuose.
HPLC metodas atliekamas naudojant įvairius skysčių chromatografus. Šiuolaikiniai skysčių chromatografai skirti sudėtingiems medžiagų mišiniams atskirti į atskirus komponentus ir atlikti kokybinę bei kiekybinę atskiriamo mišinio komponentų analizę.
didelio efektyvumo skysčių chromatografija propifenazonas
Dėl GMP įvedimo į vaistų gamybos praktiką Rusijoje. didėja šiuolaikinių unifikuotų analizės metodų naudojimo svarba tiek gamybos įmonėse, tiek valstybinės vaistų kokybės kontrolės sistemoje. Aukštos kokybės skysčių chromatografija (HPLC) yra pagrindinis medžiagų ir gatavų vaistinių preparatų kokybės analizės metodas šalyse, kuriose išvystyta farmacijos pramonė (JAV, Anglija, Japonija, ES šalys). Šis metodas pagal savo charakteristikas atitinka apie 80-90% vaistų kiekybinės analizės reikalavimus.
Bet kokių chromatografinių nustatymų atlikimo technika priklauso nuo tam tikrų Bendrieji reikalavimai. Visų pirma, būtina atkreipti dėmesį į tuos, kurie pradedantiesiems kelia daugiausiai klausimų.
1. Oro kondicionierius. Patalpoje, kurioje sumontuotas skysčių chromatografas, neturėtų būti staigių temperatūros svyravimų.
Temperatūros pokyčiai gali lemti sulaikymo, efektyvumo ir netgi atskyrimo selektyvumo pokyčius.
Vasaros karštyje nekondicionuojamose patalpose labai sunku dirbti su normalios fazės šviesiai virinančiomis mobiliosiomis fazėmis. Per dieną jie palaipsniui išgaruoja, todėl pasikeičia eliuento sudėtis.
Esant žemesnei temperatūrai, kyla problemų dirbant su eliuentais, praturtintais vandeniu ir (arba) turinčiais alkoholių. Tokių eliuentų klampumas smarkiai padidėja mažėjant temperatūrai, todėl sistemoje padidėja slėgis.
Mažų temperatūros svyravimų įtaką atskyrimui galima pašalinti termostatuojant chromatografinę kolonėlę arba visą skysčių sistemą (tai įmanoma ne visiems chromatografams).
2. Maitinimo kokybė. Dauguma šiuolaikinių chromatografų yra aprūpinti galios stabilizavimo sistemomis, tačiau vietoje tiekimo maitinimo kokybė taip pat turi būti aukšta. Jei maitinimo šaltinis nėra pakankamai geras, bet koks apibrėžimų serijos vykdymas automatiniu režimu gali sugesti dėl gedimo.
3. Tirpiklių grynumas. Mobiliosioms fazėms ruošti reikia naudoti labai grynus tirpiklius.
Apskritai judriosios fazės grynumo reikalavimai priklauso nuo aptikimo metodo, eliuavimo metodo (izokratinio arba gradiento), detektoriaus jautrumo tikslinei analitei ir jos koncentracijos.
Naudojant UV aptikimą, tirpiklių grynumo reikalavimai didėja pereinant prie trumpų bangų ilgių diapazono, mažesnio nei 230–240 nm. Izokratiniam eliuavimui su UV aptikimu, kai bangos ilgis yra didesnis nei 220–240 nm, gali būti naudojami "didelio grynumo" tirpikliai. ir distiliuotas vanduo. Visi į judriąją fazę įdedami reagentai taip pat turi būti pakankamai gryni; prieš naudojant kristalinius reagentus naudinga perkristalizuoti.
Gradientiniam eliuavimui reikalingi „skysčių chromatografijai“ skirti tirpikliai ir bidistiliatas vanduo. Specialūs gradiento eliuavimo metodo reikalavimai (atvirkštinės fazės chromatografijoje) keliami vandeninio buferio ir ypač vandens grynumui. Visų pirma, taip yra dėl to, kad pradiniame eliuavimo etape adsorbentas sugeria teršiančius komponentus iš judriosios fazės, praturtintos vandeniniu buferiu, kurie vėliau išplaunami ir chromatogramoje atsiranda „kuburėlių“ pavidalu. „slenksčiai“ ir atskiros smailės, kurios labai apsunkina naudingų analitės signalų išgavimą.
Gryniausi tirpikliai reikalingi partijoms nustatyti medžiagų pėdsakus gradiento eliuavimo režimu.
Norint atlikti nustatymą gradiento eliuavimo režimu, taip pat tikslumo nustatymą izokratiniu režimu, judančioji fazė turi būti naudojama vieną kartą, tai yra, eliuatas turi būti išmestas arba pašalintas.
Naudojant izokratinį eliuavimą, jei nėra ypatingų jautrumo problemų, panaudotą eliuentą galima naudoti pakartotinai. Sistema, kurioje eliuatas, praėjęs per detektorių, grąžinamas į judriosios fazės indą, vadinama „perdirbimo sistema“. Tokia sistema ypač naudinga, kai atliekama daug įprastinių izokratiškų matavimų standartinėse kolonėlėse (250x4,6, 150x4,6), kai srautas yra apie 1 ml/min. Tokiais atvejais perdirbimo sistema sutaupo iki 200-300 ml organinio tirpiklio per dieną. Ši ekonomiška sistema leidžia analizei naudoti labai grynus, brangius tirpiklius. Brangių tirpiklių taupymo problema nėra tokia aktuali, kai naudojamos mikrokolonelės (80x2, 100x2), nes norint atskirti reikia daug mažesnio judriosios fazės tūrio.
4. Tirpiklių degazavimas. Tirpikliai, naudojami chromatografijoje judrioms fazėms paruošti, paprastai turi ištirpusio oro. Ypač daug oro yra vandens.
Dirbant su nedegazuotu eliuentu, oro burbuliukai patenka į įvairius skysčių sistemos komponentus: siurblį, kolonėlę, kapiliarus, detektorių. Orui patekus į skysčio sistemą, chromatogramoje atsiranda dideli periodiniai triukšmai, kuriuos sukelia slėgio svyravimai skysčio sistemoje. Dėl to labai sumažėja analizės jautrumas.
Norint pašalinti orą iš jų eliuento, jis degazuojamas. Paprastai degazuojami tik atvirkštinių fazių atskyrimo eliuentai, nes vandeniniuose ir organiniuose mišiniuose yra daug ištirpusio oro. Ypač atsargiai degazavimas turi būti atliekamas gradiento eliuavimo atveju, taip pat naudojant fluorimetrinį aptikimą.
Gradientinio eliuavimo metu atvirkštinės fazės režimu sumaišomi du eliuentai - įvairių kompozicijų vandens-organiniai mišiniai. Maišant nedegazuotus eliuentus intensyviai išsiskiria ištirpęs oras, o tai labai svarbu visam nustatymui (oro burbuliukai chromatogramoje registruojami kaip ryškūs „išmetimai“ nulinėje linijoje).
Fluorimetrinio aptikimo jautrumas mažėja, kai judriojoje fazėje yra daug ištirpusio oro (fluorescencija užgesinama). Taigi, naudojant fluorimetrinį aptikimą, ypatingas dėmesys turi būti skiriamas eliuento dujų pašalinimui.
Yra trys pagrindiniai judriųjų fazių degazavimo būdai skysčių chromatografijai.
a. Vakuuminis degazavimas – eliuentas kelias minutes laikomas Claiseno kolboje vandens srovės siurblio vakuume. Dujų šalinimo metu reikia vengti eliuento užvirti.
b. Terminis degazavimas naudojamas vandeniniams-organiniams eliuentams degazuoti su didele vandens dalimi. Judanti fazė dedama į kolbą, kuri nėra hermetiškai užkimšta, ir paliekama maždaug 50°C temperatūros vandens vonioje. Po 10-15 minučių kolba užkemšama kamščiu ir atšaldoma po tekančiu vandeniu iki kambario temperatūros.
in. Degazavimas ultragarsu. Mobilioji fazė apdorojama ultragarsu keletą minučių, po to leidžiama nusistovėti 10-15 minučių. Šis metodas dažnai nėra pakankamai efektyvus vandens ir organinių eliuentų degazavimui.
Šiuolaikinės skysčių chromatografijos siurbimo sistemos turi automatines degazavimo sistemas. Tačiau atliekant gradientines analizes, abi judančias fazes geriau degazuoti iš anksto ir „rankiniu būdu“, pagal vieną iš minėtų būdų.
5. Judančios fazės filtravimas. Siekiant užtikrinti, kad siurblys veiktų be problemų, judriąją fazę pageidautina filtruoti vakuume, naudojant membraninį filtrą.
6. Kolonėlės ir skysčių sistemos komponentų plovimas. Po darbo su vandeninėmis organinėmis judriomis fazėmis, kuriose yra druskų ir rūgščių, visa skystoji sistema (įskaitant kolonėlę) turi būti nuplaunama distiliuotu vandeniu, pridedant 5-10% organinio tirpiklio. Toks praplovimas atliekamas tam, kad ne darbo valandomis papildomai nesusidėvėtų chromatografo skysčių sistemos komponentai ir pati stacionari fazė.
Tokio plovimo neatlikimas visų pirma lemia tai, kad sustabdžius siurblį iš eliuento ant jo dalių ir ant detektoriaus kiuvetės sienelių nusėda druskos. Tai savo ruožtu lemia nestabilų viso prietaiso veikimą, taip pat priešlaikinį judančių siurblio dalių nusidėvėjimą. Dėl reguliaraus druskos ir rūgšties turinčių eliuentų sistemos praplovimo gali sutrumpėti stacionarios fazės eksploatavimo laikas.
Į plovimo vandenį būtina įpilti organinio tirpiklio, kad būtų išvengta biologinio skysčio sistemos užteršimo.
7. Perėjimas į naują mobiliąją fazę, kuri nesimaišo su ankstesne. Toks perėjimas atliekamas per tarpinį tirpiklį, kuris be galo maišosi su abiem judriomis fazėmis – dažniausiai per izopropanolį arba acetoną.
Norint pereiti nuo vandeninio eliuento prie nepolinio eliuento, skysta sistema turi būti plaunama vandeniu, pridedant organinio tirpiklio, tada nuimama chromatografinė kolonėlė, sistema plaunama izopropanoliu (acetonu), sistema turi būti nuplaunamas nepoliniu eliuentu ir turi būti įrengta nauja kolonėlė.
Atvirkštiniam perėjimui chromatografinė kolonėlė pašalinama, skystoji sistema plaunama izopropanoliu (acetonu), po to vandeniniu eliuentu ir įrengiama nauja kolonėlė.
Keisdami vandeninį eliuentą į nepolinį eliuentą, įsitikinkite, kad siurblio sandariklio medžiaga yra skirta nepoliniams tirpikliams.
8. Mėginio filtravimas. Jei analizuojamame mėginyje yra neištirpusios suspensijos, pageidautina ją filtruoti, perleidžiant mėginį per membraninį filtrą, prijungtą prie švirkšto. Deja, jei mėginys yra mažas, mažesnis nei mililitras, tada jo tokiu būdu filtruoti tampa beveik neįmanoma.
Reguliariai analizuojant mėginius, kuriuose yra suspenduotų kietųjų dalelių, kolonėlės įleidimo filtras (fritas) gali užsikimšti, o tai, visų pirma, padidins slėgį sistemoje. Tokiu atveju geriau pakeisti įleidimo filtrą, o jei jo nėra, plauti organiniame tirpiklyje su ultragarsu 10-15 minučių.
Optimaliausias problemos sprendimas – prieš kolonėlę pritaikyti linijinį filtrą. Linijiniame filtre yra keičiamas fritas – toks pat, kaip ir ant kolonėlės. Frito keitimas ant linijinio filtro yra įprastas veiksmas, kurį galima atlikti gana dažnai.
9. Apsauginių kolonų taikymas. Reguliariai analizuojant „nešvarius“ mėginius, chromatografinė kolonėlė greitai užsiteršia ir praranda gebėjimą atskirti. Gerai žinoma alternatyva kruopščiam mėginio paruošimui šiuo atveju yra apsauginio stulpelio, kuris apsaugo pagrindinę kolonėlę nuo užteršimo, naudojimas.
Kartais tikslinga iš viso nerengti mėginio, o prieš pagrindinę kolonėlę įdėti linijinį filtrą ir išankstinę kolonėlę. Šios schemos pranašumai yra analizės paprastumas ir greitis naudojant mažiau darbo jėgos ir reagentų.
10. Chromatografinių kolonėlių konservavimas. Prieš pakankamai ilgai laikant, chromatografinės kolonėlės nuplaunamos ir pripildomos tirpikliu, kuris yra gana specifinis kiekvienam stacionarios fazės tipui.
Taigi chromatografinės kolonėlės, skirtos veikti normalių fazių sistemose, dažniausiai pripildomos aukštos virimo temperatūros angliavandenilių, tokių kaip izooktanas. Atvirkštinės fazės plaunamos vandeniu ir užpildomos acetonitrilu arba mažu tiekimo greičiu izopropanoliu. Fazės, skirtos darbui su vandeniniais buferiais, užpildomos vandeniu, pridedant šiek tiek natrio azido (bakteriostatinis).
Kolonėlės laikymo instrukcijos gali būti nurodytos jos pase.
11. Vandens buferių laikymas. Įprasto nustatymo atveju gali būti gana patogu iš karto paruošti didelį kiekį vandeninio buferio judriajai fazei paruošti. Deja, vandeninio buferio negalima laikyti ilgiau nei kelias dienas, nebent į jį būtų pridėta bakteriostatinio natrio azido. Judančios fazės, pagrįstos fosfatiniu buferiu, yra labai prastai saugomos.
Kartais, siekiant „padidinti tyrimo atkuriamumą“, ruošiamas didelis vandeninio buferio tūris. Paprastai tariant, naudojant šį metodą, analizės atkuriamumas nepadidėja, tačiau problemos, susijusios su buferine saugykla, yra neišvengiamos.
Paprastai tariant, atsakymas į klausimą, ar ruošti vandens buferį savaitei ar vienai dienai? - yra nulemtas vien patogumo principo.
12. Kalibravimo reguliarumas. Paprastai standartinis kalibravimas atliekamas kiekvieną dieną arba kiekvieną kartą, kai ruošiamas naujas eliuentas.
Kalibravimas atliekamas pasiekus stacionarią chromatografinės sistemos būseną; nuskaitomi parametrai yra standartinės smailės sulaikymo laikas, jos plotas (spektrofotometrinio aptikimo atveju - prie atskaitos bangos ilgio), spektriniai santykiai (naudojant skenuojantį arba diodinės matricos spektrofotometrinį detektorių).
Darbo pradžioje standartą galima analizuoti du kartus – patvirtinti sulaikymo laiko atkuriamumą.
1. Preparato "BICILLIN-3" komponentų nustatymas HPLC metodu
Bicilinas-3 yra ilgai veikiantis penicilinas ir yra benzilpenicilino (BP) natrio, novokaino ir benzatino druskų mišinys. Pagal galiojančią VFS 42-3034-98 AKS nustatymas preparate atliekamas naudojant HPLC, novokainas – spektrofotometriškai, o benzatinas (N,N1-dibenziletilendiaminas) ekstrahuojamas eteriu iš vandeninio tirpalo, prisotinto natrio chloridu. . Išgarinus eterį, benzatinas nustatomas titruojant perchloro rūgštimi.
Europos farmakopėjoje BP ir benzatino kiekis BP benzatino druskoje nustatomas naudojant gradientinį HPLC metanolio mišinyje su natrio fosfato tirpalu, kai pH 3,5.
Šio darbo tikslas – sukurti HPLC metodą izokratiniu režimu komponentams biciline-3 nustatyti.
eksperimentinė dalis
Buvo naudojamas AKO Sintez (Kurgan) pagamintas bicilinas-3. Tyrimas buvo atliktas Waters chromatografu (JAV) su 510 modelio pompa, modelio 481 UV detektoriumi ir 7125 modelio injektoriumi (Rheodyne) su 50 µL talpos dozavimo kilpa. Aptikimui buvo naudojamas 214 nm bangos ilgis, kuriame visi analizuojami junginiai yra gerai aptikti. Chromatogramų registravimas ir smailių plotų bei pagrindinių sulaikymo parametrų apskaičiavimas atliktas asmeniniu kompiuteriu su analoginiu-skaitmeniniu keitikliu ir programa Multichrome.
Atvirkštinės fazės HPLC metodas buvo tiriamas naudojant 250 x 4,6 mm dydžio Luna C18 (2) kolonėlę iš Phenomenex (JAV), nes kolonėlė anksčiau pasirodė esanti santykinai pigi, o organinių aminų smailių išeiga pagerėjo. Tuo pačiu tikslu kaip judrioji fazė buvo naudojamas acetonitrilo mišinys su buferiniu tirpalu, kurio vienas iš komponentų yra trietilaminas, kurio pH yra 5,0.
Pradinis judriosios fazės paruošimo tirpalas – 2,5 M fosforo rūgšties tirpalas, kuris titruojamas trietilaminu iki pH 5,0. HPLC buferinis tirpalas buvo paruoštas pradinį tirpalą skiedžiant 10 kartų vandeniu, 750 ml gauto buferinio tirpalo sumaišoma su 250 ml acetonitrilo. Tuo pačiu metu judriosios fazės tariamas pH padidėjo iki 5,7. Judančios fazės greitis 1 ml/min. Chromatografija buvo atlikta kambario temperatūroje. Analizės laikas 20 min.
Kadangi vaisto komponentai skiriasi rūgščių-šarmų savybėmis - BP yra rūgštis, o novokainas ir benzatinas yra bazės, padidėjus pH, jų sulaikymo laikas pH intervale, kur keičiasi jų jonizacija, pasislenka įvairiomis kryptimis. Todėl pakeitus pH, nesunku pasirinkti patogų analizuojamų komponentų sulaikymą. Tačiau padidėjus pH, pastebimai pablogėja benzatino smailės forma, o sumažėjus novokaino ir BP hidrolizės produktų skiriamoji geba yra nepakankama. Bicilino-3 komponentų atskyrimas aukščiau nurodytomis sąlygomis parodytas paveikslėlyje. Novokaino, benzatino ir BP sulaikymo laikas buvo atitinkamai 4,2, 11,6 ir 14,8 min.
Reikšmingas yra novokaino smailės išėjimas tarp 2 smailių, kurios yra BP hidrolizės produktai. Atsižvelgiant į tai, norint geriau atskirti komponentus, rekomenduojama į judriąją fazę įpilti nedidelį kiekį 2,5 M fosforo rūgšties arba trietilamino tirpalų ir kontroliuoti novokaino ir BP mišinio atskyrimą chromatografijos būdu, kurio tirpalas buvo maždaug parą laikomi kambario temperatūroje.
Kiekybiniam nustatymui į 100 ml matavimo kolbą įpilta 20–25 mg bicilino-3 ir ištirpinta 20 % vandeniniame acetonitrilo tirpale. Metanolio ar jo tirpalų naudojimas ištirpinimui paskatino dalinį BP metilinimą. Padidėjus acetonitrilo koncentracijai, padidėjo novokaino smailė. Viršutinis limitas Vaisto koncentraciją riboja jo tirpumas. BP ir benzatino kalibravimo grafikai buvo gauti naudojant BP natrio druską ir benzatino diacetatą po atitinkamo konversijos. AKS kalibravimo kreivė yra tiesinė 0,1–0,5 mg/ml, benzatino ir novokaino – 0,01–0,05 mg/ml. Komponentų nustatymo 5 vaisto serijose rezultatai pateikti 1 lentelėje, kur kiekviena reikšmė yra 5 nustatymų vidurkis. Santykinis standartinis nuokrypis buvo 1,6 % novokaino, 3,4 % benzatino ir 1,4 % BP.
Iš 1 lentelės matyti, kad kiekybinio nustatymo naudojant HPLC rezultatai atitinka ND reglamentuojamas leistinas ribas.
Siūlomo metodo teisingumui patvirtinti bicilino-3 komponentai buvo analizuojami pavyzdiniuose mišiniuose, paruoštuose sumaišant BP natrio druską, benzatino diacetatą ir novokainą. Rezultatai pateikti lentelėje.2. Rezultatai perskaičiuojami į pradinius komponentus.
Kiekviena reikšmė 2 lentelės stulpelyje „Rasta“ yra vidutinis 3 nustatymų rezultatas. Vidutinis santykinis nuokrypis buvo 2,2 % benzatino, 0,9 % novokaino ir 0,8 % BP, o tai koreliuoja su santykiniais vidutiniais standartiniais nuokrypiais, nustatytais analizuojant komponentus realiuose mėginiuose. Dėl benzatino rezultatų sklaida yra šiek tiek didesnė nei kitų komponentų, o tai paaiškinama mažu aukščiu ir netaisyklingos formos smailės ir atitinkamai didesnė integravimo klaida. Kita priežastis, susijusi su didelių klaidų nustatant benzatiną, analizuojant stipriai adsorbuotas medžiagas gali atsirasti injektoriaus atminties efektas. Tačiau net ir tokia sklaida, šiek tiek didesnė už priimtiną analizei naudojant HPLC metodą, yra gana priimtina nustatant benzatiną.
išvadas
1. Sukurta „Bicilino-3“ preparato komponentų aptikimo ir kiekybinio nustatymo metodika.
2. Metodas buvo išbandytas su daugybe vaistų partijų ir patvirtintas žinomos sudėties pavyzdinių mišinių analize.
2. HPLC analizuojant preparatus, kurių sudėtyje yra propifenazono
Propifenazonas (4-izopropil-2,3-dimetil-1-fenil-3-pirazolin-5-onas; izopropilantipirinas) priklauso pirazolono serijos nenarkotiniams analgetikams ir yra kombinuotų nereceptinių vaistų dalis. Šiuo metu medicinos praktikoje plačiai naudojamos kofetino tabletės (sudėtis: propifenazonas-0,21 g, paracetamolis-0,25 g, kofeinas-0,05 g, kodeino fosfatas-0,01 g) ir saridonas (paracetamolis-0,25 g, propifenazonas-0,15 g, kofeinas g). Remiantis esama reglamentuojančia dokumentacija, kofetino tablečių autentiškumui patvirtinti naudojama chromatografija ploname sorbento sluoksnyje. Kiekybinį nustatymą siūloma atlikti atskirose pasvertose vaisto porcijose, naudojant skirtingus kiekvieno komponento metodus: naudojant spektrofotometriją, titrimetriją, plonasluoksnės chromatografijos ir spektrofotometrijos derinį. Saridono norminiuose dokumentuose paracetamolis, kofeinas ir propifenazonas nustatomi HPLC metodu 12,5 cm ilgio kolonėlėse su Merck Lichrospher C18 sorbentu ir judriąja kompozicijos faze: metanolis-0,01 M fosforo rūgštis santykiu 30:70.
Šio darbo tikslas – sukurti metodus, kaip aptikti ir kiekybiškai įvertinti kofetino ir saridono tablečių komponentus naudojant HPLC.
Naudojome Alkaloid Skopje (Makedonijos Respublika) gaminamas kofetino tabletes, Roche Nicholas S.A. Laboratories, Gaillard (Prancūzija) saridoną ir jų komponentų medžiagas. Tyrimas atliktas naudojant buitinį mikrokoloninį skysčių chromatografą „Milichrom-4“ su UV spektrofotometriniu detektoriumi, 8 cm ilgio kolonėlę su atvirkštinės fazės sorbentu Separon-C18 kaip stacionarią fazę. Nagrinėjamų junginių poliškumas, geras jų tirpumas vandenyje ir acetonitrile lėmė, kad judančiąja faze buvo pasirinkti vandens-acetonitrilo mišiniai skirtingais santykiais. Judančios fazės buvo tiriamos acetonitrilo ir vandens santykiu 9:1; 7:3; 6:4; 8:2 ir acetonitrilas-vanduo-dietilaminas (3:2:0,2). Siekiant išvengti normalios fazės sąveikos, dėl kurios sunku toliau kontroliuoti judriosios fazės sudėtį, buvo vengiama naudoti judriąsias fazes, kurių organinio tirpiklio tūrinė dalis yra didesnė nei 80 %. Mažesnė nei 5% tirpiklio tūrio dalis sukelia judriosios fazės funkcinį nestabilumą ir sulaikymo laiko nepakartojamumą. Dietilamino kaip modifikatoriaus įvedimas į judriosios fazės sudėtį leido atskirti visus 4 kofetino tablečių komponentus. Yra žinoma, kad oktadecilo silikagelio paviršiuje yra daug likusių silanolio grupių, galinčių keistis jonais. Dietilaminas pašalina silanolio grupes iš chromatografinio proceso, pagerina smailės formą, sutrumpina analizės laiką ir reguliuoja pH silikagelio paviršiuje. Matavimas atliktas tokiomis sąlygomis: registracijos skalė 2,0, sulaikymo laikas 0,8 s, eliuento srautas 50 μl/min., mėginio įpurškimo tūris 3 μl. Smailės aptikimas buvo atliktas esant 2 bangos ilgiams – 238 ir 276 nm.
Identifikavimas atliktas pagal sulaikymo parametrus, kurie anksčiau buvo nustatyti tirtų medžiagų standartiniuose tirpaluose.
Kofetino tablečių komponentai atskiriami naudojant acetonitrilo-vandens-dietilamino (3:2,2:0,2) judriąją fazę. Paracetamolio sulaikymo laikas buvo 3,08 minutės, propifenazono – 5,73 minutės, kofeino – 4,0 minutės, kodeino – 4,67 minutės.
Saridono komponentai taip pat gali būti atskirti naudojant acetonitrilo-vandens (8:2) judriąją fazę. Paracetamolio sulaikymo laikas - 3,9 min., propifenazono - 5,11 min., kofeino - 4,44 min.
Kiekybiniam įvertinimui buvo naudojamas absoliutus kalibravimo metodas. Tiesioginė proporcinga medžiagos koncentracijos priklausomybė nuo smailės aukščio buvo pastebėta paracetamoliui 50–200 μg / ml, propifenazonui - 25-128 μg / ml, kofeinui - 20-50 μg / ml, kodeinas - 59-234 μg / ml.
HPLC metodas turi tam tikrų apribojimų analizuojant sudėtingus mišinius. Tuo pačiu metu mišinyje esant makro ir mikro kiekiams medžiagų, atsiranda kolonėlės perkrova, kuri turi įtakos atskyrimo kokybei ir išeinančių smailių formai. Kofetine kodeino fosfato kiekis, palyginti su paracetamoliu ir propifenazonu, yra 21-25 kartus mažesnis, todėl rekomenduojama ekstrahuoti skysčiu, kad būtų atskirtas kodeinas nuo likusių tabletės komponentų. Anksčiau nustatėme, kad paracetamolis, propifenazonas ir kofeinas iš vandeninių tirpalų, kurių pH 2,0, ekstrahuojami vieną kartą etilo acetatu atitinkamai 87,43, 87,29 ir 87,84%, o kodeinas lieka visiškai vandeniniame tirpale ir jo ekstrahavimui. ir koncentracijai būtina naudoti chloroformą, kurio pH 9,0-10,0.
Paracetamolio, propifenazono ir kofeino kiekybinio nustatymo saridono ir kofetino tabletėse metodas 20 tablečių grūstuve sumalama į smulkius vienalyčius miltelius, pasveriama apie 0,01 g (tiksliai pasverta) susmulkintų tablečių miltelių ir dedama į į 25 ml talpos matavimo kolbą įpilama 10 ml acetonitrilo ir gerai išmaišoma.
Kolbos turinys iki žymės praskiedžiamas acetonitrilu, sumaišomas ir filtruojamas. Tirpalas įpurškiamas į chromatografo kolonėlę 3,0 μl tūriu. Paracetamolio, propifenazono ir kofeino kiekis nustatomas absoliutaus kalibravimo metodu. Nustatymo rezultatai pateikti 1 ir 2 lentelėse, iš kurių matyti, kad gauti duomenys yra leistinose turinio ribose pagal normatyvinę dokumentaciją (RD).
Kodeino fosfato kiekybinio nustatymo kofetino tabletėse metodas. Apie 0,2 g susmulkintų tablečių (tiksliai pasvertų) ištirpinama 20 ml vandens, gerai išmaišoma, kol gaunamas vienalytis tirpalas, perfiltruojama per filtrą smulkioms ir labai smulkioms nuosėdoms, filtras perplaunamas 10 ml išgryninto vandens. Tirpalas parūgštinamas 10% sieros rūgštimi iki pH 2,0. Ekstrahuokite tris kartus po 10 ml etilo acetato. Ekstraktai išmetami. Į vandeninį tirpalą įpilama 25 % amoniako tirpalo iki pH 9,0-10,0. Tris kartus ekstrahuojama chloroformu po 10 ml. Sujungti chloroformo ekstraktai dedami į porcelianinius indus ir išgarinami kambario temperatūroje. Sausos liekanos ištirpinamos acetonitrile, supilamos į 25 ml talpos matavimo kolbą ir tuo pačiu tirpikliu sureguliuojamos iki žymės 3 μl gauto tirpalo įpurškiama į chromatografo kolonėlę ir aprašytomis sąlygomis nustatomas kodeinas. Nustatymo rezultatai pateikti lentelėje.3.
Siūlomų metodų tikslumui įvertinti ir rezultatų atkuriamumui patikrinti buvo paruošti ir ištirti modelių mišiniai. Duomenys apie saridono tablečių pavyzdį pateikti lentelėje.4. Kaip matyti iš 4 lentelės, santykinė nustatymo paklaida neviršija ±1,19 % paracetamolio, ±1,16 % propifenazono ir ±1,63 % kofeino.
Saridono tablečių sudedamųjų dalių kiekybinio nustatymo pavyzdiniuose mišiniuose metodas. Tikslūs paracetamolio (apie 0,08 g), propifenazono (apie 0,05 g) ir kofeino (apie 0,016 g) svoriai pasveriami, supilami į 50 ml matavimo kolbą, ištirpinami nedideliame acetonitrilo tūryje ir sureguliuojami iki žymės tuo pačiu tirpikliu. . Paimama 2,5 ml alikvotinė dalis ir supilama į 25 ml matavimo kolbą, tūris sureguliuojamas iki žymės tuo pačiu tirpikliu, sumaišomas ir filtruojamas. Tirpalas įpurškiamas į chromatografo kolonėlę 3 μl tūriu.
išvadas
1. Sukurta technika kofetino ir saridono tablečių komponentams aptikti naudojant HPLC.
Paracetamolio sulaikymo laikas buvo 3,08 minutės, propifenazono – 5,73 minutės, kofeino – 4 minutės ir kodeino – 4,67 minutės.
2. Kofetino ir saridono tablečių komponentų kiekybiniam nustatymui pasiūlytas HPLC metodas.
Santykinė nustatymo paklaida buvo ±1,19-1,21% paracetamolio, ±1,16-1,71% propifenazono, ±1,22-1,63% kofeino ir ±2,95% kodeino.
3. Vaisto "Adanol" standartizavimas
Farmacijos įmonė "Polisan" sukūrė daugybę sudėtingų medžiagų apykaitos vaistų, kurie stimuliuoja smegenų medžiagų apykaitos procesus, įskaitant "Cytoflavin" (injekcijos, tabletės) ir "Adanol". "Adanol" turi ryškių antihipoksinių ir anti-išeminių savybių ir yra perspektyvus vaistas pacientams, sergantiems insulto pasekmėmis, gydyti. Tai tabletės dozavimo forma, padengta enterine danga.
Jį sudaro gintaro rūgštis (YA), piracetamas (Pc), riboksinas (Rb), nikotinamidas (NA), piridoksino hidrochloridas (PG), riboflavino mononukleotidas (RF).
Darbo tikslas – sukurti kokybinio ir kiekybinio UC nustatymo sudėtinguose daugiakomponentiniuose mišiniuose metodą, naudojant vaisto „Adanol“ pavyzdį.
Naudojome aukšto slėgio skysčių chromatografą iš Shimadzu (Japonija) su UV detektoriumi ir Hypersil BDS C18 kolonėle iš Supelco Inc. grūdelių dydis 5 µm, ilgis 250 mm, vidinis skersmuo 4,6 mm. Judanti fazė yra vandens-organinė fazė, pagrįsta fosfatiniu buferiu (pH 2,6-7,0). Aptikimo bangos ilgis yra 206 nm. Analizės režimas izokratinis, eliuavimo greitis 500 µl/min; mėginio tūris 20 µl. UV spektrai buvo užfiksuoti Shimadzu UV mini-1240 spektrofotometru.
Daugumos vaistų, sudarančių vaistą, kiekybiniam nustatymui buvo pasiūlyti spektrofotometriniai analizės metodai. Tačiau palyginus preparato komponentų spektrines charakteristikas, paaiškėjo, kad YA, PG, NA, Pb ir Pc absorbcijos sritys UV zonoje persidengia (1 pav.).
Atsižvelgiant į tai, jų kiekis mišinyje negali būti nustatytas tiesiogine spektrofotometrija, todėl šiuo atveju patartina naudoti HPLC metodą. Tik RF savitoji sugerties sritis yra didesnė nei 350 nm (lmax=373, E1% 1cm=202 ir lmax=445 nm, E1% 1cm=243), todėl jam siūloma atlikti kokybinę ir kiekybinę analizę spektrofotometriniu metodu. .
Remiantis gautais duomenimis, buvo pasirinktas optimalus darbinis bangos ilgis 5 medžiagų analizei, kuris yra lopt = 206 nm (žr. 1 pav.). Ši vertė yra UC UV spektro maksimumas, kurio savitoji sugertis yra mažiausia (lmax=206 nm E1% 1cm=5,8), palyginti su kitais mišinio komponentais (žr. lentelę).
Kadangi visos preparate esančios medžiagos yra jonogeninės, jų analizei patartina naudoti atvirkštinės fazės chromatografiją, naudojant nepolines stacionariąsias ir polines judančias fazes. Atliekant joninių junginių atvirkštinės fazės chromatografiją, pH reikšmė yra vienas iš veiksnių, reikšmingai įtakojančių atskirų medžiagų atskyrimo efektyvumą. Dirbant su šiuolaikiniais atvirkštinės fazės sorbentais, buferiniai tirpalai, kurių pH yra nuo 2,0 iki 8,0, paprastai naudojami kaip judriosios fazės dalis. Kadangi pasirinktas optimalus veikimo bangos ilgis yra 206 nm, geriausia naudoti fosfatinį buferį, nes jis neturi padėties UV bangos ilgio diapazone, viršijančiame 200 nm.
Norėdami ištirti YaC elgesį skirtingos vertybės Jo pH spektrai paimti fosfatiniuose buferiniuose tirpaluose pH 7,0 ir 2,6 (2 pav.). Esant pH 2,6, stebimas hipochrominis UC molekulinės formos poveikis - absorbcija sumažėja 3 kartus, palyginti su spektru, kai pH yra 7,0 (esant tokiai pH vertei, UC disociacija yra visiškai slopinama). Atsižvelgiant į tai, optimali judriosios fazės pH vertė yra 7,0. Toliau tirta judriosios fazės sudėties ir pH įtaka vaisto komponentų atskyrimo efektyvumui. Esant pH 2,6, mišinys visiškai nesiskyrė į atskiras smailes - Pc, Na ir PG neatsiskiria ir išeina kaip pirmoji smailė, po to YA ir Pb atskirų smailių pavidalu. Esant pH 5,5, taip pat nebuvo visiškai atskirti komponentai. Esant pH 7,0, mišinio komponentai visiškai atsiskyrė. Visos medžiagos pasirodė kaip atskiros smailės tokia seka: YA, Pc, PG, NA ir Pb. Tačiau atskyrimo procesas yra ilgas - 45-50 minučių.
Siekiant užtikrinti didesnę judriosios fazės eliuavimo galią ir paspartinti atskyrimo procesą, į jos sudėtį būtina įtraukti mažiau polinį organinį tirpiklį. Iš tirpiklių, dažniausiai naudojamų kaip eliuavimo agentai HPLC, galėtume naudoti acetonitrilą ir metanolį pagal UV šviesos skaidrumo ribą pasirinktu darbiniu bangos ilgiu (lopt = 206 nm), kurių skaidrumo ribos yra atitinkamai 195 ir 205 nm.
2% metanolio įvedimas į judriosios fazės sudėtį sumažino proceso laiką, tačiau HA smailė turėjo didelę asimetriją, o Pb smailė buvo uždėta ant HA smailės uodegos. Sumažinus metanolio koncentraciją iki 1%, Pb ir HA smailės nesutapo, tačiau padidėjo HA smailės asimetrija. Norėdami jį sumažinti, į judriąją fazę, kurioje yra 1% metanolio, buvo įvestas acetonitrilas.
Atlikus eksperimentus buvo parinkta judri fazė - vandeninė-organinė fazė, susidedanti iš fosfatinio buferio pH 7,0, turinčio 1% metanolio ir 0,5% acetonitrilo, kuris užtikrino efektyvų visų 5 komponentų atskyrimą (3 pav.). Bendras chromatografijos laikas šioje sistemoje buvo 35 min., o komponentų sulaikymo laikas buvo apytikslis (min.): 5,3 YaK, 15 Pc, 19,3 PG, 26 NA ir 31 Pb.
Kiekybinis nustatymas atliktas išoriniu etaloniniu metodu, naudojant atskirų komponentų etaloninių mėginių tirpalus.
Siūlomo kiekybinio nustatymo metodo metrologinės charakteristikos buvo ištirtos modelio mišiniuose 5 kartus ir pateiktos lentelėje.
Kaip matyti iš lentelės, naudojant sukurtą metodą preparate "Adanol" galima nustatyti visus 5 komponentus, kurių santykinė paklaida ne didesnė kaip 3%. pasitikėjimo lygis 95%.
Be pagrindinių preparato komponentų smailių, aukščiau nurodytomis sąlygomis gauta chromatograma atskleidė hipoksantino ir nikotino rūgšties smailes, esančias pradinėse medžiagose, taip pat tas, kurios susidarė atitinkamai hidrolizės metu iš Pb ir NA. Taigi sukurta technika leidžia kokybiškai ir kiekybiškai nustatyti šias pašalines priemaišas preparate.
išvadas
1. Nustatytos optimalios sąlygos gintaro rūgšties kiekybinei analizei HPLC metodu daugiakomponentiniame mišinyje.
2. Sukurta metodika kokybinei ir kiekybinei vaisto „Adanol“ komponentų, įskaitant priemaišas, analizei, santykinė nustatymo paklaida ne didesnė kaip 3%.
Naudotos literatūros sąrašas
1. M.A. Kazminas, A.V. Michalevas, A.P. Arzamascevas "Vaisto "BICILLIN-3" komponentų nustatymas HPLC būdu" // Vaistinė - Nr. 5 - 2002 - p.5-6.
2. T.Kh. Vergeichik, N.S. Onegov "HPLC tiriant preparatus, kurių sudėtyje yra propifenazono" // Farmacija - Nr. 6 - 2002 - p.13-16.
3. A.Yu. Petrovas, S.A. Dmitričenko, A.L. Kovalenko, L.E. Aleksejeva "Vaisto "Adanol" standartizavimas // Vaistinė - Nr. 5 - 2002 - p.11-13.
Papildomas
1. Baram G.I., Fedorova G.A. // Chromatografijos taikymas maisto, mikrobiologijos ir medicinos pramonėje: Mat. Vses. Konf. - Gelendžikas, 1990 - S.43-44.
2. Krichkovskaya L.V., Chernenkaya L.A. // Chromatografijos taikymas maisto, mikrobiologijos ir medicinos pramonėje: Mat. Vses. Konf. - Gelendžikas, 1990 spalio 8-12, M., 1990. - P.49.
3. Chromatografija: Praktinis metodo taikymas: Iš 2 dalių. 2 dalis - M.: Mir, 1986. - 422 p.