Příčina smrti mikroorganismů pod vlivem ionizujícího záření. Vliv fyzikálních a chemických faktorů na mikroorganismy
Vliv fyzikálních faktorů.
Vliv teploty. Při určitých teplotních rozmezích se vyvíjejí různé skupiny mikroorganismů. Bakterie rostoucí při nízkých teplotách se nazývají psychrofily, při středních (asi 37 ° C) - mezofily, při vysokých - termofily.
K psychrofilním mikroorganismům zahrnuje velkou skupinu saprofytů - obyvatele půdy, moří, sladké vody a odpadní voda(železité bakterie, pseudomonády, luminiscenční bakterie, bacily). Některé z nich mohou způsobit zkažení potravin v chladu. Některé patogenní bakterie mají schopnost růstu i při nízkých teplotách (původce pseudotuberkulózy se množí při teplotě 4 °C). V závislosti na kultivační teplotě se mění vlastnosti bakterií. Teplotní rozsah, při kterém je možný růst psychrofilních bakterií, se pohybuje od -10 do 40 °C a teplotní optimum - od 15 do 40 °C, což se blíží teplotnímu optimu mezofilních bakterií.
mezofilové zahrnují hlavní skupinu patogenních a oportunních bakterií. Rostou v rozmezí teplot 10-47 °C; optimální růst pro většinu z nich je 37 °C.
Při vyšších teplotách (od 40 do 90 °C) se vyvíjejí teplomilné bakterie. Na dně oceánu v horkých sulfidových vodách žijí bakterie, které se vyvíjejí při teplotě 250-300 ° C a tlaku 262 atm.
Termofilovéžijí v horkých pramenech, účastní se procesů vlastního ohřevu hnoje, obilí, sena. Přítomnost velkého množství termofilů v půdě svědčí o její kontaminaci hnojem a kompostem. Protože hnůj je nejbohatší na termofily, jsou považovány za indikátor kontaminace půdy.
Mikroorganismy dobře snášejí nízké teploty. Proto je lze skladovat zmrazené po dlouhou dobu, a to i při teplotě kapalného plynu (-173 °C).
Sušení. Dehydratace způsobuje narušení funkcí většiny mikroorganismů. Nejcitlivější na vysychání jsou patogenní mikroorganismy (původci kapavky, meningitidy, cholery, břišního tyfu, úplavice aj.). Mikroorganismy chráněné sputovým hlenem jsou odolnější.
Sušení ve vakuu ze zmrazeného stavu - lyofilizace - slouží k prodloužení životaschopnosti, uchování mikroorganismů. Lyofilizované kultury mikroorganismů a imunobiologické přípravky jsou skladovány po dlouhou dobu (několik let), aniž by se změnily jejich původní vlastnosti.
Účinek záření. Neionizující záření - ultrafialové a infračervené paprsky sluneční světlo, stejně jako ionizující záření - gama záření radioaktivních látek a vysokoenergetických elektronů působí na mikroorganismy již po krátké době škodlivě. UV paprsky se používají k dezinfekci vzduchu a různých předmětů v nemocnicích, porodnicích, mikrobiologických laboratořích. K tomuto účelu se používají baktericidní lampy UV záření o vlnové délce 200-450 nm.
Ionizující záření se používá ke sterilizaci jednorázového plastového mikrobiologického nádobí, živných médií, obvazů, léků atd. Existují však bakterie, které jsou vůči ionizujícímu záření odolné, například Micrococcus radiodurans byl izolován z jaderného reaktoru.
Sterilizace zahrnuje úplnou inaktivaci mikrobů ve zpracovávaných předmětech.
Existují tři hlavní způsoby sterilizace: tepelná, radiační, chemická.
Tepelná sterilizace na základě citlivosti mikrobů na vysokou teplotu. Při 60 "C a přítomnosti vody dochází k denaturaci bílkovin, degradaci nukleových kyselin, lipidů, následkem čehož vegetativní formy mikrobů odumírají. Spory obsahující velmi velké množství vody v vázaný stav a mající husté slupky, jsou inaktivovány při 160-170 °C.
Pro tepelnou sterilizaci se používá především suché teplo a tlaková pára.
sterilizace suchým teplem provádí ve vzduchových sterilizátorech (dřívější název je „suché pece nebo Pasteurovy pece“). Vzduchový sterilizátor je pevně uzavřená kovová skříň vytápěná elektřinou a vybavená teploměrem. Dezinfekce materiálu v něm se provádí zpravidla při 160 °C po dobu 120 minut. Jsou však možné i jiné režimy: 200 °C - 30 minut, 180 "C - 40 minut.
Suchým teplem sterilizujte laboratorní sklo a jiné sklo, nářadí, silikonovou pryž, tedy předměty, které neztrácejí své vlastnosti při vysokých teplotách.
Většina sterilizovaných předmětů takové zacházení nevydrží, a proto dochází k jejich dekontaminaci parní sterilizátory.
Zpracování párou pod tlakem v parních sterilizátorech (starý název - "autoklávy") je nejuniverzálnější metodou sterilizace.
Parní sterilizátor (existuje mnoho jeho modifikací) - kovový válec se silnými stěnami, hermeticky uzavřený, sestávající z vodní páry a sterilizačních komor. Přístroj je vybaven tlakoměrem, teploměrem a dalším přístrojovým vybavením. V autoklávu vzniká zvýšený tlak, který vede ke zvýšení bodu varu.
Protože pára kromě vysoké teploty působí i na mikroby, spory umírají již při 120 °C. Nejběžnější provozní režim parního sterilizátoru: 2 atm - 121 ° C - 15-20 min. Doba sterilizace se zkracuje s rostoucím atmosférickým tlakem a následně i bodem varu (136 °C - 5 min). Mikrobi umírají během pár sekund, ale materiál se zpracovává delší dobu, protože za prvé musí být vysoká teplota i uvnitř sterilizovaného materiálu a za druhé existuje tzv. bezpečnostní rezerva (počítáno pro malou poruchu autokláv).
Většina položek je sterilizována v autoklávu: obvazy, spodní prádlo, kovové nástroje odolné proti korozi, živná média, roztoky, infekční materiál atd.
Jedním z typů tepelné sterilizace je frakční sterilizace, která se používá ke zpracování materiálů, které nesnesou teploty nad 100 °C, například ke sterilizaci živných médií se sacharidy, želatinou. Zahřívají se ve vodní lázni na 80°C po dobu 30-60 minut.
V současné době se používá jiný způsob tepelné sterilizace, určený speciálně pro mléko - ultra vysoká teplota(UHT): mléko se zpracovává několik sekund při 130-150 °C.
Chemická sterilizace zahrnuje použití toxických plynů: ethylenoxidu, směsi OB (směs ethylenoxidu a methylbromidu v hmotnostním poměru 1:2,5) a formaldehydu. Tyto látky jsou alkylačními činidly, jejich schopnost inaktivovat aktivní skupiny v enzymech, jiných proteinech, DNA a RNA v přítomnosti vody vede ke smrti mikroorganismů.
Sterilizace plyny se provádí za přítomnosti páry při teplotě 18 až 80 °C ve speciálních komorách. V nemocnicích se používá formaldehyd, v průmyslových podmínkách - ethylenoxid a směs OB.
Před chemickou sterilizací musí být všechny produkty určené ke zpracování vysušeny.
Tento typ sterilizace je nebezpečný pro personál, pro životní prostředí a pro pacienty používající sterilizované předměty (většina sterilizačních prostředků zůstává na předmětech).
Existují však předměty, které mohou být poškozeny teplem, jako jsou optické přístroje, rádiová a elektronická zařízení, předměty vyrobené z tepelně neodolných polymerů, proteinová kultivační média atd., pro které je vhodná pouze chemická sterilizace. Například kosmické lodě a satelity, vybavené přesným zařízením, jsou dekontaminovány směsí plynů (ethylenoxid a methylbromid), aby se dekontaminovaly.
V V poslední době díky širokému použití v lékařské praxi výrobků vyrobených z termolabilních materiálů vybavených optickými zařízeními, jako jsou endoskopy, se začaly používat dekontaminace chemickými roztoky. Po vyčištění a dezinfekci se zařízení nasadí určitý čas(od 45 do 60 min) ve sterilizačním roztoku, poté je nutné zařízení omýt sterilní vodou. Pro sterilizaci a mytí používejte sterilní nádoby s víkem. Sterilizovaný a vymytý produkt ze sterilizačního roztoku se osuší sterilními ubrousky a umístí do sterilní nádoby. Veškeré manipulace se provádějí za aseptických podmínek a ve sterilních rukavicích. Tyto produkty skladujte ne déle než 3 dny.
Radiační sterilizace se provádí buď pomocí gama záření, nebo pomocí urychlených elektronů.
Radiační sterilizace je alternativou ke sterilizaci plynem v průmyslovém prostředí a používá se také v případech, kdy předměty, které mají být sterilizovány, nemohou odolat vysokým teplotám. Radiační sterilizace umožňuje zpracovávat velké množství předmětů najednou (například jednorázové injekční stříkačky, krevní transfuzní systémy). Vzhledem k možnosti sterilizace ve velkém měřítku je použití této metody zcela oprávněné, navzdory její ekologické nebezpečnosti a neekonomické.
Dalším způsobem sterilizace je filtrace.. Filtrace pomocí různých filtrů (keramické, azbestové, skleněné), a zejména membránových ultrafiltrů z koloidních roztoků nitrocelulózy či jiných látek, umožňuje zbavit tekutiny (krevní sérum, léky) bakterií, plísní, prvoků a dokonce i virů. Pro urychlení procesu filtrace je obvyklé vytvářet zvýšený tlak v nádobě s filtrovanou kapalinou nebo snížený tlak v nádobě s filtrátem.
V současné době jsou stále více využívány moderní metody sterilizace, vytvořené na základě nových technologií, využívajících plazmu, ozón.
Vliv fyzikálních faktorů .
Vliv teploty. Při určitých teplotních rozmezích se vyvíjejí různé skupiny mikroorganismů. Bakterie rostoucí při nízkých teplotách se nazývají psychrofily, při středních (asi 37 ° C) - mezofily, při vysokých - termofily.
K psychrofilním mikroorganismům platí velká skupina saprofyti - obyvatelé půdy, moří, sladké vody a odpadních vod (železité bakterie, pseudomonády, luminiscenční bakterie, bacily). Některé z nich mohou způsobit zkažení potravin v chladu. Některé patogenní bakterie mají schopnost růstu i při nízkých teplotách (původce pseudotuberkulózy se množí při teplotě 4 °C). V závislosti na kultivační teplotě se mění vlastnosti bakterií. Teplotní rozsah, při kterém je možný růst psychrofilních bakterií, se pohybuje od -10 do 40 °C a teplotní optimum - od 15 do 40 °C, což se blíží teplotnímu optimu mezofilních bakterií.
mezofilové zahrnují hlavní skupinu patogenních a oportunních bakterií. Rostou v rozmezí teplot 10-47 °C; optimální růst pro většinu z nich je 37 °C.
Při vyšších teplotách (od 40 do 90 °C) se vyvíjejí teplomilné bakterie. Na dně oceánu v horkých sulfidových vodách žijí bakterie, které se vyvíjejí při teplotě 250-300 ° C a tlaku 262 atm.
Termofilovéžijí v horkých pramenech, účastní se procesů vlastního ohřevu hnoje, obilí, sena. Přítomnost velkého množství termofilů v půdě svědčí o její kontaminaci hnojem a kompostem. Protože hnůj je nejbohatší na termofily, jsou považovány za indikátor kontaminace půdy.
Mikroorganismy dobře snášejí nízké teploty. Proto je lze skladovat zmrazené po dlouhou dobu, a to i při teplotě kapalného plynu (-173 °C).
Sušení. Dehydratace způsobuje narušení funkcí většiny mikroorganismů. Nejcitlivější na vysychání jsou patogenní mikroorganismy (původci kapavky, meningitidy, cholery, břišního tyfu, úplavice aj.). Mikroorganismy chráněné sputovým hlenem jsou odolnější.
Sušení ve vakuu ze zmrazeného stavu - lyofilizace - slouží k prodloužení životaschopnosti, uchování mikroorganismů. Lyofilizované kultury mikroorganismů a imunobiologické přípravky jsou skladovány po dlouhou dobu (několik let), aniž by se změnily jejich původní vlastnosti.
Účinek záření. Neionizující záření – ultrafialové a infračervené paprsky slunečního záření, stejně jako ionizující záření – záření gama radioaktivních látek a vysokoenergetických elektronů působí na mikroorganismy již po krátké době škodlivě. UV paprsky se používají k dezinfekci vzduchu a různých předmětů v nemocnicích, porodnicích, mikrobiologických laboratořích. K tomuto účelu se používají baktericidní lampy UV záření o vlnové délce 200-450 nm.
Ionizující záření se používá ke sterilizaci jednorázového plastového mikrobiologického nádobí, živných médií, obvazů, léků atd. Existují však bakterie, které jsou vůči ionizujícímu záření odolné, například Micrococcus radiodurans byl izolován z jaderného reaktoru.
Působení chemikálií . Chemikálie mohou mít na mikroorganismy různé účinky: slouží jako zdroje potravy; nevyvíjet žádný vliv; stimulovat nebo inhibovat růst. Chemické substance které ničí mikroorganismy v prostředí, se nazývají dezinfekční prostředky. Antimikrobiální chemikálie mohou být baktericidní, virucidní, fungicidní atd.
Chemikálie používané k dezinfekci patří do různých skupin, mezi nimiž jsou nejvíce zastoupeny látky související se sloučeninami obsahujícími chlor, jód a brom a oxidačními činidly.
Kyseliny a jejich soli (oxolinová, salicylová, boritá) mají také antimikrobiální účinek; alkálie (amoniak a jeho soli).
Sterilizace- zahrnuje úplnou inaktivaci mikrobů v předmětech, které prošly zpracováním.
Dezinfekce- postup zahrnující ošetření předmětu kontaminovaného mikroby za účelem jejich zničení do takové míry, že při použití tohoto předmětu nemohou způsobit infekci. Dezinfekce zpravidla zabije většinu mikrobů (včetně všech patogenů), ale spory a některé rezistentní viry mohou zůstat v životaschopném stavu.
Asepse- soubor opatření zaměřených na zamezení pronikání původce infekce do rány, do orgánů pacienta při operacích, léčebných a diagnostických výkonech. Metody asepse se používají k boji s exogenní infekcí, jejímž zdrojem jsou pacienti a přenašeči bakterií.
Antiseptika- soubor opatření zaměřených na zničení mikrobů v ráně, patologickém ohnisku nebo těle jako celku, k prevenci nebo odstranění zánětlivého procesu.
Dysbióza. Přípravky na obnovu mikrobioty.Státeubióza - dynamická rovnováha normální mikroflóry a lidského těla - může být narušena vlivem faktorů prostředí, stresu, širokého a nekontrolovaného užívání antimikrobiálních látek, radioterapie a chemoterapie, špatné výživy, chirurgických zákroků atd. V důsledku toho je narušena odolnost vůči kolonizaci . Abnormálně pomnožené přechodné mikroorganismy produkují toxické metabolické produkty – indol, skatol, amoniak, sirovodík.
Stavy, které se vyvinou v důsledku ztráty normálních funkcí mikroflóry, se nazývajídysbakterióza adysbióza .
S dysbakteriózou u bakterií, které tvoří normální mikroflóru, přetrvávají kvantitativní a kvalitativní změny. Při dysbióze dochází ke změnám i mezi jinými skupinami mikroorganismů (viry, houby atd.). Dysbióza a dysbakterióza mohou vést k endogenním infekcím.
Dysbiózy jsou klasifikovány podle etiologie (plísňové, stafylokokové, proteinové atd.) a podle lokalizace (dysbióza úst, střev, pochvy atd.). Změny ve složení a funkcích normální mikroflóry jsou doprovázeny různými poruchami: rozvoj infekcí, průjem, zácpa, malabsorpční syndrom, gastritida, kolitida, peptický vřed, zhoubné novotvary, alergie, urolitiáza, hypo- a hypercholesterolémie, hypo- a hypertenze, kaz, artritida, poškození jater atd.
Porušení normální lidské mikroflóry je definováno takto:
1. Identifikace druhů a kvantitativního složení zástupců mikrobiocenózy určitého biotopu (střevo, ústa, pochva, kůže atd.) - výsevem z ředění studovaného materiálu nebo otisky, splachováním na vhodná živná média (Blaurock médium - pro bifidobakterie; médium MPC-2 - pro laktobacily; anaerobní krevní agar - pro bakteroidy; Levinovo nebo Endovo médium - pro enterobakterie; žlučový agar - pro enterokoky; krevní agar - pro streptokoky a hemofily; masový peptonový agar s furaginem - pro Pseudomonas aeruginosa, Sabouraudovo médium - na houby atd.).
2. Stanovení mikrobiálních metabolitů - markerů dysbiózy v testovaném materiálu (mastné kyseliny, hydroxymastné kyseliny, aldehydy mastných kyselin, enzymy atd.). Například detekce beta-aspartylglycinu a beta-aspartylysinu ve stolici ukazuje na narušení střevní mikrobiocenózy, protože tyto dipeptidy jsou normálně metabolizovány střevní anaerobní mikroflórou.
Pro obnovení normální mikroflóry: a) proveďte selektivní dekontaminaci; b) předepisovat přípravky probiotik (eubiotik) získaných z lyofilizovaných živých bakterií - zástupců normální střevní mikroflóry - bifidobakterie (bifidumbacterin), Escherichia coli (kolibakterin), laktobacily (laktobakterin) atd.
Probiotika- léky, které při užívání působí per os normalizační účinek na lidský organismus a jeho mikroflóru.
Prebiotika - různé látky, které slouží k výživě zástupců norem. Mikrobiota a zlepšují střevní motilitu. eubiotika - m/o kultur, které patří k normální střevní mikrobiotě. Například - laktobakterin, vitoflor, linex.
imerzní mikroskop.Ponorná mikroskopie(z lat.immersio- ponoření) - metoda mikroskopický zkoumání malých objektů pomocí imerze objektivsvětelný mikroskop Středa s vys index lomu umístěný mezi mikroskopický preparát a čočka.
Pro výzkum, speciální imerzní čočky(objektivy pro olejová imerze má černý pruh na rámu, blízko přední čočky; čočky pro ponoření do vody - bílý pruh).
kapalinové ponoření
Pro imerzní mikroskopii byly použity různé kapaliny. Nalezen nejrozšířenější Cedrový olej (index lomu n=1,515), glycerol(n=1,4739) a voda (destilovaná n=1,3329). Solný má n=1,3346.
Ponoření do vody. V praxi bylo „ponoření do vody“ široce používáno ještě před vynálezem samotného konceptu. ponoření, když objektiv mikroskop dávat pozor na obyvatele rybníky nebo louže, zcela ponořené ve vodě. To vám umožní zvýšit rozlišeníčočka a mikroskopický systém jako celek.
Pro studie ve světelné mikroskopii, speciální čočky pro ponoření do vody mající zvýšenou numerickou aperturou díky tomu, že index lomu vody je vyšší než index lomu vzduchu.
Olejová imerze. Tradičně se cedrový olej používá jako médium pro olejovou imerzi. Má však podstatnou nevýhodu: jak na vzduchu postupně oxiduje, houstne, žloutne a postupně se mění v příliš viskózní tmavou kapalinu.
11. Historie mikrobiologie. Etapy. Úkoly. Historii vývoje mikrobiologie lze rozdělit do pěti etap: heuristické, morfologické, fyziologické, imunologické a molekulárně genetické.
Pasteur učinil řadu mimořádných objevů. V krátkém období od roku 1857 do roku 1885 dokázal, že kvašení (mléčné, alkoholové, octové) není chemický proces, ale je způsobeno mikroorganismy; vyvrátil teorii spontánního generování; objevil fenomén anaerobiózy, tzn. možnost života mikroorganismů v nepřítomnosti kyslíku; položil základy dezinfekce, asepse a antisepse; objevil způsob, jak se chránit před infekčními nemocemi pomocí očkování.
Mnohé objevy L. Pasteura přinesly lidstvu obrovské praktické výhody. Zahříváním (pasterizací) nemocí piva a vína byly poraženy produkty kyseliny mléčné způsobené mikroorganismy; aby se zabránilo hnisavým komplikacím ran, bylo zavedeno antiseptikum; Na základě principů L. Pasteura bylo vyvinuto mnoho vakcín pro boj s infekčními nemocemi.
Význam děl L. Pasteura však daleko přesahuje jen tyto praktické úspěchy. L. Pasteur přivedl mikrobiologii a imunologii do zásadně nových pozic, ukázal roli mikroorganismů v životě lidí, hospodářství, průmyslu, infekční patologii, stanovil principy, kterými se mikrobiologie a imunologie v naší době rozvíjí.
L. Pasteur byl navíc vynikajícím učitelem a organizátorem vědy.
Práce L. Pasteura o očkování otevřely novou etapu ve vývoji mikrobiologie, právem nazývanou imunologická.
Princip atenuace (oslabení) mikroorganismů pomocí průchodů vnímavým zvířetem nebo udržováním mikroorganismů v nepříznivých podmínkách (teplota, sušení) umožnil L. Pasteurovi získat vakcíny proti vzteklině, antraxu, kuřecí choleře; tento princip se stále používá při přípravě vakcín. L. Pasteur je tedy zakladatelem vědecké imunologie, i když již před ním byla známá metoda prevence neštovic infikováním lidí kravskými neštovicemi, kterou vyvinul anglický lékař E. Jenner. Tato metoda však nebyla rozšířena na prevenci dalších onemocnění.
Robert Koch. Fyziologické období ve vývoji mikrobiologie je spojeno i se jménem německého vědce Roberta Kocha, který vyvinul metody získávání čistých kultur bakterií, barvení bakterií při mikroskopii a mikrofotografii. Známá je také Kochova triáda formulovaná R. Kochem, která se stále používá při stanovení původce onemocnění.
Úkoly. - studium biologických vlastností patogenních organismů - vývoj metod pro diagnostiku typů způsobených onemocnění - vývoj metod pro boj s patogenním m/o - tvorba metod pro stimulaci m/o, které jsou užitečné pro člověka
bakteriální buňku skládá se z buněčná stěna, cytoplazmatická membrána, cytoplazma s inkluzemi a jádro, zvané nukleoid. Existují další struktury: kapsle, mikrokapsle, hlen, bičíky, pili. Některé bakterie jsou za nepříznivých podmínek schopny tvořit spory.
buněčná stěna. V buněčné stěně grampozitivní bakterie obsahuje malé množství polysacharidů, lipidů, bílkovin. Hlavní složkou tlusté buněčné stěny těchto bakterií je vícevrstvý peptidoglykan (murein, mukopeptid), který tvoří 40-90 % hmoty buněčné stěny. Teichoové kyseliny (z řec. teichos- stěna).
Do buněčné stěny Gram-negativní bakterie pronikají do vnější membrány a jsou pomocí lipoproteinu spojeny se spodní vrstvou peptidoglykanu. Na ultratenkých úsecích bakterií má vnější membrána podobu zvlněné třívrstvé struktury podobné vnitřní membráně, která se nazývá cytoplazmatická. Hlavní složkou těchto membrán je bimolekulární (dvojitá) vrstva lipidů. Vnitřní vrstva vnější membrány je reprezentována fosfolipidy a vnější vrstva obsahuje lipopolysacharid.
Funkce buněčné stěny :
Určuje tvar buňky.
Chrání článek před mechanickým poškozením zvenčí a odolává výraznému vnitřnímu tlaku.
Má vlastnost polopropustnosti, proto přes ni selektivně pronikají živiny z prostředí.
Nese na svém povrchu receptory pro bakteriofágy a různé chemikálie.
Metoda detekce buněčné stěny- elektronová mikroskopie, plazmolýza.
L-formy bakterií, jejich medicínský význam L-formy jsou bakterie zcela nebo částečně bez buněčné stěny (protoplast +/- zbytek buněčné stěny), proto mají zvláštní morfologii ve formě velkých a malých kulovitých buněk. Schopný reprodukce.
14. Způsoby kultivace virů. Virologická metoda. Pro kultivaci virů se používají buněčné kultury, kuřecí embrya a citlivá laboratorní zvířata. Stejné metody se používají pro kultivaci rickettsie a chlamydií, obligátních intracelulárních bakterií, které nerostou na umělých živných půdách.
Buněčné kultury. Buněčné kultury se připravují ze zvířecích nebo lidských tkání. Kultury se dělí na primární (netransplantovatelné), semitransplantovatelné a transplantovatelné.
Příprava primární buněčné kultury sestává z několika po sobě jdoucích fází: mletí tkáně, separace buněk trypsinizací, promytí vzniklé homogenní suspenze izolovaných buněk z trypsinu, následuje suspenze buněk v živném médiu, které zajistí jejich růst, např. v médiu 199 s přídavkem telecího krevního séra.
Transplantované plodiny na rozdíl od primárních jsou adaptovány na podmínky, které zajišťují jejich trvalou existenci in vitro a přetrvávají několik desítek pasáží.
Kontinuální jednovrstvé buněčné kultury se připravují z maligních a normálních buněčných linií, které mají schopnost se za určitých podmínek in vitro po dlouhou dobu množit. Patří sem maligní HeLa buňky původně izolované z karcinomu děložního čípku, Hep-3 (z lymfoidního karcinomu), stejně jako normální lidské amniové buňky, opičí ledviny atd.
K polotrvalým plodinám jsou lidské diploidní buňky. Představují buněčný systém, který uchovává během 50 pasáží (až rok) diploidní sadu chromozomů, typickou pro somatické buňky použitá tkanina. Diploidní lidské buňky nepodléhají maligní transformaci, což je ve srovnání s nádorovými buňkami příznivé.
O rozmnožování (rozmnožování) virů v buněčné kultuře posuzováno podle cytopatického efektu (CPE), který lze detekovat mikroskopicky a je charakterizován morfologickými změnami v buňkách.
Povaha CPD virů se využívá jak pro jejich detekci (indikaci), tak pro orientační identifikaci, tedy určení jejich druhu.
Jedna z metod Indikace virů je založena na schopnosti povrchu buněk, ve kterých se rozmnožují, adsorbovat erytrocyty – hemadsorpční reakce. Pro vložení do kultury buněk infikovaných viry se přidá suspenze erytrocytů a po určité době kontaktu se buňky promyjí izotonickým roztokem chloridu sodného. Adherující erytrocyty zůstávají na povrchu buněk zasažených virem.
Další metodou je hemaglutinační reakce (RG). Používá se k detekci virů v kultivační tekutině buněčné kultury nebo chorionallantoické nebo plodové vodě kuřecího embrya.
Počet virových částic se stanoví titrací pomocí CPE v buněčné kultuře. K tomu se kultivační buňky infikují desetinásobným ředěním viru. Po 6-7 dnech inkubace se vyšetřují na přítomnost CPP. Nejvyšší ředění, které způsobuje CPE v 50 % infikovaných kultur, se považuje za titr viru. Titr viru je vyjádřen jako počet cytopatických dávek.
přesnější kvantitativní metodaúčtování jednotlivých virových částic je metoda plaku.
Některé viry lze detekovat a identifikovat pomocí inkluzíže se tvoří v jádře nebo cytoplazmě infikovaných buněk.
Kuřecí embrya. Kuřecí embrya jsou ve srovnání s buněčnými kulturami mnohem méně kontaminována viry a mykoplazmaty a mají také relativně vysokou životaschopnost a odolnost vůči různým vlivům.
K získání čistých kultur rickettsie, chlamydií a řady virů pro diagnostické účely i k přípravě různých přípravků (vakcíny, diagnostica) se používají 8-12denní kuřecí embrya. Reprodukce zmíněných mikroorganismů se posuzuje podle morfologických změn zjištěných po otevření embrya na jeho membránách.
Na reprodukci některých virů, jako jsou chřipka, neštovice, lze usuzovat podle hemaglutinační reakce (RHA) s kuřecími nebo jinými erytrocyty.
Mezi nevýhody této metody patří nemožnost detekce zkoumaného mikroorganismu bez předchozího otevření embrya a také přítomnost velkého množství proteinů a dalších sloučenin v něm, které brání následnému čištění rickettsie nebo virů při výrobě různé přípravky.
laboratorní zvířata. Druhová citlivost zvířat na konkrétní virus a jejich věk určují reprodukční schopnost virů. V mnoha případech jsou na určitý virus citlivá pouze novorozená zvířata (například kojené myši jsou citlivé na viry Coxsackie).
Výhodou této metody oproti jiným je možnost izolace těch virů, které se špatně množí v kultuře nebo v embryu. Mezi jeho nevýhody patří kontaminace těla pokusných zvířat cizorodými viry a mykoplazmaty a také nutnost následné infekce buněčné kultury pro získání čisté linie tohoto viru, což prodlužuje dobu studia. Virologická metoda zahrnuje kultivaci virů, jejich indikaci a identifikaci. Materiály pro virologický výzkum mohou být krev, různá tajemství a exkrece, biopsie lidských orgánů a tkání. K diagnostice arbovirových onemocnění se často provádějí krevní testy. Ve slinách lze detekovat viry vztekliny, příušnic a herpes simplex. Výtěry z nosohltanu se používají k izolaci původce chřipky, spalniček, rhinovirů, respiračního syncyciálního viru, adenovirů. Ve výplachech ze spojivky se nacházejí adenoviry. Ze stolice jsou izolovány různé enteroviry, adeno-, reo- a rotaviry. K izolaci virů se používají buněčné kultury, kuřecí embrya a někdy i laboratorní zvířata. Zdrojem buněk jsou tkáně extrahované z člověka během operace, orgány embryí, zvířat a ptáků. Používají se normální nebo maligně degenerované tkáně: epiteliální, fibroblastický typ a smíšené. Lidské viry se nejlépe množí v kulturách lidských nebo opičích ledvinových buněk. Většina patogenních virů se vyznačuje přítomností tkáňové a typové specifity. Například poliovirus se reprodukuje pouze v buňkách primátů, což určuje nutnost výběru vhodné kultury. K izolaci neznámého patogena je vhodné infikovat současně 3-4 buněčné kultury, protože jedna z nich může být citlivá. patnáct. Mikroskopické metody (fluorescenční, tmavé pole, fázový kontrast, elektronové).
Luminiscenční (nebo fluorescenční) mikroskopie. Na základě jevu fotoluminiscence.
Světélkování- záře látek, ke které dochází po vystavení jakýmkoli zdrojům energie: světlu, elektronovým paprskům, ionizujícímu záření. Fotoluminiscence- luminiscence předmětu pod vlivem světla. Když je luminiscenční objekt osvětlen modrým světlem, vyzařuje paprsky červené, oranžové, žluté nebo zelené. Výsledkem je barevný obrázek objektu. Luminiscenční metoda mikroskopie zaujímá významné místo ve studiu mikroorganismů. Luminiscence (neboli fluorescence) je emise světla buňkou v důsledku absorbované energie. Jen málo bakterií (luminiscenčních) je schopno zářit vlastním světlem v důsledku intenzivních oxidačních procesů, které v nich probíhají s výrazným uvolňováním energie.
Většina mikroorganismů získává schopnost luminiscovat nebo fluoreskovat, když je osvětlena ultrafialovými paprsky po předběžném obarvení speciálními barvivy - fluorochromy. Absorbováním krátkých ultrafialových vlnových délek objekt vyzařuje delší vlnové délky viditelného spektra. V důsledku toho se zvyšuje rozlišovací schopnost mikroskopu. To umožňuje studovat menší částice. Častěji se používají fluorochromová barviva: akridinová oranž, auramin, korifosfin, fluorescein ve formě velmi slabých vodných roztoků.
Při barvení Corifosphinem dávají difterické korynebakterie v ultrafialovém světle žlutozelenou záři, Mycobacterium tuberculosis při barvení auramin-rhodaminem - zlatooranžová. Úspěšná mikroskopie vyžaduje jasný zdroj světla, kterým je vysokotlaká rtuť-křemenná lampa. Mezi zdroj světla a zrcadlo je umístěn filtr modrofialového světla, který propouští pouze krátké a střední vlnové délky ultrafialového světla. Jakmile jsou na čočce, tyto vlny v ní vybudí luminiscenci. Aby to bylo vidět, na okulár mikroskopu je nasazen žlutý filtr, který propouští dlouhovlnné fluorescenční světlo, které vzniká při průchodu paprsků objektem. Krátké vlny, které studovaný objekt neabsorbuje, jsou tímto filtrem odstraněny a odříznuty.
Existují speciální luminiscenční mikroskopy ML-1, ML-2, ML-3, stejně jako jednoduchá zařízení: sada OI-17 (neprůhledný osvětlovač), OI-18 (osvětlovací zařízení s rtuťově-křemennou výbojkou SVD-120A), které umožňují použít pro fluorescenční mikroskopii konvenční biologický mikroskop.
mikroskopie v temném poli. Mikroskopie v tmavém zorném poli je založena na fenoménu difrakce světla při silném bočním osvětlení drobných částic suspendovaných v kapalině (Tyndalův efekt). Efektu je dosaženo použitím paraboloidního nebo kardioidního kondenzátoru, který v biologickém mikroskopu nahrazuje klasický kondenzátor. Studium mikroorganismů v tmavém poli (dark field microscopy) je založeno na jevu rozptylu světla při silném bočním osvětlení částic suspendovaných v kapalině. Mikroskopie v tmavém poli umožňuje vidět menší částice než ve světelném mikroskopu. Provádí se pomocí běžného světelného mikroskopu vybaveného speciálními kondenzory (paraboloidní nebo kardioidní kondenzor), který vytváří dutý kužel světla. Vrchol tohoto dutého kužele se shoduje s předmětem. Paprsky světla, procházející objektem studia v šikmém směru, nedopadají do objektivu mikroskopu. Do něj proniká pouze světlo rozptýlené předmětem. Proto jsou na tmavém pozadí preparátu pozorovány jasně svítící obrysy mikrobiálních buněk a dalších částic. Mikroskopie v tmavém poli umožňuje určit tvar mikroba a jeho pohyblivost. Typicky se mikroskopie v tmavém poli používá při studiu mikroorganismů, které slabě absorbují světlo a nejsou viditelné pod světelným mikroskopem, jako jsou spirochety. Chcete-li vytvořit tmavé pole, můžete také použít běžný Abbe kondenzor umístěním kruhu z černého papíru do jeho středu. V tomto případě se světlo nastaví a vycentruje na světelné pole a poté se Abbeův kondenzor ztmaví. Preparát pro mikroskopii se připravuje metodou drcené kapky. Tloušťka sklíčka by neměla přesáhnout 1 - 1,1 mm, jinak bude ohnisko kondenzoru v tloušťce skla. Mezi kondenzátor a podložní sklíčko je umístěna kapalina (destilovaná voda) s indexem lomu blízkým indexu lomu skla. Při správném nastavení osvětlení jsou na tmavém poli vidět jasné svítící body.
Fázová kontrastní mikroskopie. Zařízení s fázovým kontrastem umožňuje vidět průhledné předměty v mikroskopu. Získávají vysoký kontrast obrazu, který může být pozitivní nebo negativní. Pozitivní fázový kontrast je tmavý obraz předmětu ve světlém zorném poli, negativní fázový kontrast je světlý obraz předmětu na tmavém pozadí.
Pro mikroskopii s fázovým kontrastem se používá konvenční mikroskop a přídavné zařízení s fázovým kontrastem a také speciální iluminátory. Lidské oko dokáže zaznamenat změny vlnové délky a intenzity viditelného světla pouze při zkoumání neprůhledných předmětů, kterými se světelné vlny stejnoměrně nebo nerovnoměrně tlumí, tedy mění velikost amplitudy. Takové objekty se nazývají amplituda. Obvykle se jedná o fixované a obarvené preparáty mikroorganismů nebo tkáňové řezy. Živé buňky díky vysokému obsahu vody slabě absorbují světlo, takže téměř všechny jejich součásti jsou průhledné.
Metoda mikroskopie s fázovým kontrastem je založena na tom, že živé buňky a mikroorganismy, které slabě absorbují světlo, jsou přesto schopny měnit fázi paprsků, které jimi procházejí (fázové objekty). V různých částech buněk, které se liší indexem lomu a tloušťkou, bude změna fáze různá. Tyto fázové rozdíly, ke kterým dochází, když viditelné světlo prochází živými předměty, lze zviditelnit pomocí mikroskopie s fázovým kontrastem.
Mikroskopie s fázovým kontrastem se provádí pomocí konvenčního světelného mikroskopu a speciálního zařízení, které zahrnuje fázově kontrastní kondenzátor s prstencovými membránami a prstencovou fázovou destičku. Pro prvotní zacílení slouží pomocný mikroskop, pomocí kterého je zajištěno, že do čočky proniká přes prstencovou clonu kondenzoru pouze prstenec světla. Paprsek světla procházející průhledným předmětem se rozdělí na dva paprsky: přímý a difraktovaný (lomený). Přímý paprsek, který pronikl do částice, je zaostřen na prstenec fázové desky a difraktovaný paprsek takříkajíc prochází kolem částice, aniž by jí prošel. Proto jsou jejich optické dráhy různé a vzniká mezi nimi fázový rozdíl. Ta je značně zvýšena pomocí fázové desky a díky tomu se zvyšuje kontrast obrazu, což umožňuje pozorovat nejen fázové objekty jako celek, ale také strukturální detaily, například živé buňky a mikroorganismy.
Elektronová mikroskopie. Umožňuje pozorovat předměty, jejichž rozměry přesahují rozlišení světelného mikroskopu (0,2 mikronu). Elektronový mikroskop se používá ke studiu virů, jemné struktury různých mikroorganismů, makromolekulárních struktur a dalších submikroskopických objektů.
16. Metody stanovení citlivosti bakterií na antibiotika. Stanovit citlivost bakterií na antibiotika (antibiogramy) obvykle se používá:
Agarová difúzní metoda. Na agaru živné médium testovací mikrob je naočkován a poté jsou aplikována antibiotika. Obvykle se léky aplikují buď do speciálních jamek v agaru, nebo se na povrch semene položí disky s antibiotiky („disková metoda“). Výsledky se zaznamenávají za den podle přítomnosti nebo nepřítomnosti mikrobiálního růstu kolem otvorů (disků). Disková metoda - kvalitativní a umožňuje posoudit, zda je mikrob citlivý nebo odolný vůči léku.
Metody stanovení minimální inhibiční a baktericidní koncentrace, tj. minimální hladina antibiotika, která zabrání viditelnému růstu mikrobů v živném médiu nebo je zcela sterilizuje. to kvantitativní metody, které vám umožňují vypočítat dávku léku, protože koncentrace antibiotika v krvi musí být výrazně vyšší než minimální inhibiční koncentrace pro infekční agens. Zavedení adekvátních dávek léku je nezbytné pro účinnou léčbu a prevenci vzniku rezistentních mikrobů.
Existují zrychlené metody využívající automatické analyzátory.
Stanovení citlivosti bakterií na antibiotika diskovou metodou. Studovaná bakteriální kultura je naseta trávníkem na živný agar nebo AGV médium v Petriho misce.
AGV médium: suchý živný rybí vývar, agar-agar, hydrogenfosforečnan sodný. Médium se připravuje ze suchého prášku podle návodu.
Papírové disky obsahující určité dávky různých antibiotik se umístí na očkovaný povrch pomocí pinzety ve stejné vzdálenosti od sebe. Kultury se inkubují při 37 °C do dalšího dne. Podle průměru růstových inhibičních zón studované bakteriální kultury se posuzuje její citlivost na antibiotika.
Pro získání spolehlivých výsledků je nutné používat standardní disky a živná média, k jejichž kontrole se používají referenční kmeny příslušných mikroorganismů. Disková metoda neposkytuje spolehlivá data pro stanovení citlivosti mikroorganismů na polypeptidová antibiotika, která špatně difundují do agaru (například polymyxin, ristomycin). Pokud mají být tato antibiotika použita k léčbě, doporučuje se stanovit citlivost mikroorganismů metodou sériových ředění.
Stanovení citlivosti bakterií na antibiotika metodou sériových ředění. Tato metoda určuje minimální koncentraci antibiotika, která inhibuje růst studované bakteriální kultury. Nejprve se připraví zásobní roztok obsahující specifickou koncentraci antibiotika (µg/ml nebo IU/ml) ve speciálním rozpouštědle nebo tlumivém roztoku. Připraví se z něj všechna následná ředění v bujónu (v objemu 1 ml), načež se do každého ředění přidá 0,1 ml studované bakteriální suspenze obsahující 10 6 -10 7 bakteriálních buněk na 1 ml. Do poslední zkumavky (kontrola kultury) přidejte 1 ml bujónu a 0,1 ml bakteriální suspenze. Inokulace se inkubují při 37 °C do dalšího dne, poté se zaznamenají výsledky experimentu na zákalu živného média ve srovnání s kontrolou kultury. Poslední zkumavka s průhledným živným médiem indikuje zpomalení růstu studované bakteriální kultury pod vlivem minimální inhibiční koncentrace (MIC) antibiotika v ní obsaženého.
Hodnocení výsledků stanovení citlivosti mikroorganismů na antibiotika se provádí podle speciální hotové tabulky, která obsahuje hraniční hodnoty průměrů zón inhibice růstu pro rezistentní, středně odolné a citlivé kmeny, stejně jako hodnoty MIC antibiotik pro rezistentní a citlivé kmeny.
kmeny jsou citlivé mikroorganismy, jejichž růst je inhibován při koncentracích léku nalezených v krevním séru pacienta při použití běžných dávek antibiotik. Středně odolné kmeny jsou, k potlačení růstu, který vyžaduje koncentrace, které se vytvářejí v krevním séru se zavedením maximálních dávek léku. Mikroorganismy jsou odolné, jejichž růst není potlačován lékem v koncentracích vytvořených v těle při použití maximálních přípustných dávek.
Stanovení antibiotika v krvi, moči a dalších tělesných tekutinách. Dvě řady zkumavek jsou umístěny ve stojanu. V jednom z nich se připraví ředění referenčního antibiotika, v druhém testovací kapalina. Poté se do každé zkumavky přidá suspenze testovacích bakterií připravená v Hiss médiu s glukózou. Při stanovení penicilinu, tetracyklinů, erytromycinu v testované kapalině se jako testovací bakterie používá standardní kmen S. aureus a při stanovení streptomycinu E. coli. Po inkubaci inokulací při 37 °C po dobu 18-20 hodin jsou zaznamenány výsledky experimentu o zákalu média a jeho barvení indikátorem v důsledku rozkladu glukózy testovacími bakteriemi. Koncentrace antibiotika se stanoví vynásobením nejvyššího ředění testované tekutiny, které inhibuje růst testovaných bakterií, minimální koncentrací referenčního antibiotika, které inhibuje růst stejných testovacích bakterií. Pokud je například maximální ředění testovací kapaliny, která inhibuje růst testovacích bakterií, 1:1024 a minimální koncentrace referenčního antibiotika, které inhibuje růst stejných testovacích bakterií, je 0,313 µg/ml, pak je produkt 1024x0,313=320 ug/ml je koncentrace antibiotika v 1 ml.
Stanovení schopnosti S. aureus produkovat beta-laktamázu. Do baňky s 0,5 ml denní bujónové kultury standardního kmene stafylokoka citlivého na penicilin přidejte 20 ml roztaveného a na 45 °C vychlazeného živného agaru, promíchejte a nalijte do Petriho misky. Po ztuhnutí agaru se do středu misky na povrch média umístí disk obsahující penicilin. Studované kultury se vysévají podél radiusů disku smyčkou. Inokulace se inkubují při 37 °C do dalšího dne, poté se zaznamenají výsledky experimentu. Schopnost studovaných bakterií produkovat beta-laktamázu se posuzuje podle přítomnosti růstu standardního kmene stafylokoka kolem jedné nebo druhé ze studovaných kultur (kolem disku).
Biologové označují bakterie za evoluční recept na úspěch – jsou tak odolné vůči jakýmkoli podmínkám vnější prostředí. Někteří z nich se cítí skvěle i při smrtelných dávkách záření.
Mikrobiolog John Batista z University of Louisiana toho viděl hodně. O svém prvním setkání s mikrobem, vtipně přezdívaným „Superbug Conan“, však řekl: „Upřímně řečeno, nebylo pro mě snadné uvěřit v realitu existence takového organismu.“
Na začátku 60. let objevil Thomas Brock v Yellowstonském národním parku bakterie, které dokázaly odolat teplotám blízkým bodu varu. Poté začali mikrobiologové nacházet stále více nových typů extrémních mikrobů. Conan však předčil všechny: nejodolnější mikroorganismus, odolává krutému mrazu, žhavému vedru, kyselým koupelím i jedům. Nejpozoruhodnější ze všeho však byla jeho reakce na vysoké dávky radiace. Dokonce ani 1500násobný přebytek dávky, která je pro jiné organismy smrtelná, bakteriím neublížil.
Conan byl poprvé objeven v 50. letech minulého století ve zkažených masových konzervách určených pro armádu. Kvůli ochraně před bakteriální kontaminací se konzervované potraviny ve Spojených státech obvykle sterilizují pomocí radioaktivního záření. O to více byli vědci překvapeni, když ve sklenicích spatřili růžovou plíseň s vůní shnilého zelí, jednoznačně bakteriálního původu. Byli zmatení. Koneckonců, záření obvykle způsobuje hluboké poškození genetického materiálu v živých organismech. Pokud výše takové škody přesáhne určitou kritická úroveň mikroorganismus umírá. Ale pro Conana zákon není napsán. Jaké mechanismy zachrání nepopsatelného drobečka před smrtí v jakékoli situaci?
Zmatení mikrobiologové se pustili do rozluštění záhady Conana. Zkoumali jeho genetický materiál před a po ozáření a analyzovali metabolické procesy. K jejich překvapení výsledky ukázaly, že Conan také velmi trpěl radiací, ale zároveň věděl, jak překonat její katastrofální účinky.
Pokud některé jedy nebo ionizující záření způsobí relativně malé poškození pouze jednoho ze dvou řetězců DNA organismu, pak radioaktivní záření způsobí poškození obou řetězců DNA a jejich obnova je pro organismus často neúnosná. Takže pro smrt E. coli žijící v lidském střevě stačí dvě nebo tři taková poškození DNA.
Conan naopak rychle obnovil dvě stě takových „poruchů“. Faktem je, že v procesu evoluce se vyvinul efektivní mechanismy obnovení poškození genů – včetně speciálního enzymu, který hledá vhodné „náhradní díly“ v dědičném materiálu, zkopíruje je a vlepí do poškozených míst.
Obnovu Conanovy DNA usnadňuje další okolnost: Conanův genom se skládá ze čtyř kruhových molekul DNA a v každé buňce není genom přítomen v jedné, jako u většiny bakterií, ale v několika kopiích. Právě díky těmto kopiím jsou poškozená místa obnovena. Vzhledem k tomu, že buňka je nejzranitelnější vůči záření v době dělení, kdy se kruhová molekula DNA musí otevřít, vyvinul Conan jiný způsob ochrany: bakterie zanechává tři molekuly složené do prstence a čtvrtou používá pro potřeby rozmnožování. Pokud je tento chromozom poškozen zářením, náhradní chromozomy slouží jako templáty, ze kterých tělo kopíruje správné genové sekvence.
V roce 2007 objevil mikrobiolog Michael J. Daly další důvod Conanovy hypertolerance: bakterie má neuvěřitelně vysokou intracelulární koncentraci manganu, prvku, který také pomáhá opravovat poškození DNA.
A přesto, navzdory učiněným objevům, záhada Conanovy superodolnosti vůči radiaci dosud nebyla zcela vyřešena. Výzkum je v plném proudu: vědci doufají, že efektivně využijí Konan k vyčištění půdy kontaminované radiací.
ovace. Teplotní rozsah, při kterém je možný růst psychrofilních bakterií, se pohybuje od -10 do 40 °C a teplotní optimum - od 15 do 40 °C, což se blíží teplotnímu optimu mezofilních bakterií.
Mezi mezofily patří hlavní skupina patogenních a oportunních bakterií. Rostou v rozmezí teplot 10-47 °C; optimální růst pro většinu z nich je 37 °C.
Při vyšších teplotách (od 40 do 90 °C) se vyvíjejí teplomilné bakterie. Na dně oceánu v horkých sulfidových vodách žijí bakterie, které se vyvíjejí při teplotě 250-300 ° C a tlaku 262 atm. Termofilové žijí v horkých pramenech, účastní se procesů vlastního ohřevu hnoje, obilí, sena. Přítomnost velkého množství termofilů v půdě svědčí o její kontaminaci hnojem a kompostem. Protože hnůj je nejbohatší na termofily, jsou považovány za indikátor kontaminace půdy.
Při sterilizaci se zohledňuje teplotní faktor. Vegetativní formy bakterií hynou při teplotě 60 °C během 20-30 minut; spory - v autoklávu při 120 °C pod tlakem páry.
Mikroorganismy dobře snášejí nízké teploty. Proto je lze skladovat zmrazené po dlouhou dobu, a to i při teplotě kapalného plynu (-173 °C).
Sušení. Dehydratace způsobuje narušení funkcí většiny mikroorganismů. Nejcitlivější na vysychání jsou patogenní mikroorganismy (původci kapavky, meningitidy, cholery, břišního tyfu, úplavice aj.). Mikroorganismy chráněné sputovým hlenem jsou odolnější. Bakterie tuberkulózy ve sputu tedy vydrží vysychání až 90 dní. Některé bakterie tvořící kapsulo a hlen jsou odolné vůči vysychání. Ale bakteriální spory jsou obzvláště odolné.
Sušení ve vakuu ze zmrazeného stavu - lyofilizace - slouží k prodloužení životaschopnosti, uchování mikroorganismů. Lyofilizované kultury mikroorganismů a imunobiologické přípravky jsou skladovány po dlouhou dobu (několik let), aniž by se změnily jejich původní vlastnosti.
Radiační působení. Neionizující záření - ultrafialové a infračervené paprsky slunečního světla, stejně jako ionizující záření - gama záření radioaktivní látky a vysokoenergetické elektrony mají po krátké době škodlivý účinek na mikroorganismy. UV paprsky se používají k dezinfekci vzduchu a různých předmětů v nemocnicích, porodnicích, mikrobiologických laboratořích. K tomuto účelu se používají baktericidní lampy UV záření o vlnové délce 200-450 nm.
Ionizující záření se používá ke sterilizaci jednorázového plastového mikrobiologického nádobí, živných médií, obvazů, léků atd. Existují však bakterie, které jsou vůči ionizujícímu záření odolné, například Micrococcus radiodurans byl izolován z jaderného reaktoru.
Působení chemikálií. Chemikálie mohou mít na mikroorganismy různé účinky: slouží jako zdroje potravy; nevyvíjet žádný vliv; stimulovat nebo inhibovat růst. Chemické látky, které ničí mikroorganismy v prostředí, se nazývají dezinfekční prostředky. Proces ničení mikroorganismů v prostředí se nazývá dezinfekce. Antimikrobiální chemikálie mohou být baktericidní, virucidní, fungicidní atd.
Chemikálie používané k dezinfekci patří do různých skupin, mezi nimiž jsou nejvíce zastoupeny látky související se sloučeninami obsahujícími chlor, jód a brom a oxidačními činidly. V přípravcích obsahujících chlór má chlor baktericidní účinek. Mezi tyto léky patří bělidlo, chloraminy, pantocid, neopantocid, chlornan sodný, chlornan vápenatý, dezam, chlordesin, sulfochlorantin aj. Jodopyrin a dibromantin jsou považovány za slibné antimikrobiální léky na bázi jódu a bromu. Intenzivní oxidační činidla jsou peroxid vodíku, manganistan draselný atd. Mají výrazný baktericidní účinek.
Mezi fenoly a jejich deriváty patří fenol, lysol, lyso-id, kreosot, kreolin, chlor-p-naftol a hexachlorofen.
Vyrábí se také baktericidní mýdla: fenol, dehet, zelená lékařská, "Hygiena". Mýdlo "Hygiene" obsahuje 3-5% hexachlorofenu, má nejlepší baktericidní vlastnosti a doporučuje se k mytí rukou zaměstnanců infekčních nemocnic, porodnic, dětských ústavů, stravovacích zařízení a mikrobiologických laboratoří.
Kyseliny a jejich soli (oxolinová, salicylová, boritá) mají také antimikrobiální účinek; alkálie (amoniak a jeho soli, borax); alkoholy (70-80° ethanol, atd.); aldehydy (formaldehyd, p-propiolakton).
Slibnou skupinou dezinfekčních prostředků jsou povrchově aktivní látky příbuzné kvartérním sloučeninám a amfolytům, které mají baktericidní, detergentní vlastnosti a nízkou toxicitu (nirtan, amfolan aj.).
Pro dezinfekci přesných nástrojů (např. kosmické lodě), stejně jako zařízení a přístroje, používají plynnou směs ethylenoxidu s methylbromidem. Dezinfekce se provádí v hermetických podmínkách.
Vliv biologických faktorů. Mikroorganismy jsou mezi sebou v různých vztazích. Společné bytí dvou různých organismů se nazývá symbióza (z řeckého simbióza – společný život). Existuje několik variant užitečných vztahů: metabióza, mutualismus, komenzalismus, satelitismus.
Metabióza - vztah mezi mikroorganismy, při kterém jeden mikroorganismus využívá pro svůj život odpadní látky jiného organismu. Metabióza je charakteristická pro půdní nitrifikační bakterie, které využívají k metabolismu amoniak, odpadní produkt amonifikačních půdních bakterií.
Mutualismus je vzájemně prospěšný vztah mezi různými organismy. Příkladem mutualistické symbiózy jsou lišejníky - symbióza houby a modrozelené řasy. Houba získává organické látky z buněk řas a dodává jim minerální soli a chrání je před vysycháním.
Komensalismus (z lat. commensalis - společník) - soužití jedinců odlišné typy ve kterém jeden druh těží ze symbiózy, aniž by poškozoval druhý. Komenzálové jsou bakterie, zástupci normální lidské mikroflóry.
Satelitismus je zvýšení růstu jednoho typu mikroorganismu pod vlivem jiného mikroorganismu. Například kolonie kvasinek nebo sarcinu, uvolňující metabolity do živného média, stimulují růst kolonií mikroorganismů kolem sebe. Při společném růstu více druhů mikroorganismů se mohou aktivovat jejich fyziologické funkce a vlastnosti, což vede k rychlejšímu působení na substrát.
Antagonistické vztahy nebo antagonistická symbióza jsou vyjádřeny ve formě nepříznivého účinku jednoho typu mikroorganismu na jiný, což vede k poškození nebo dokonce smrti druhého. Mikroorganismy-antagonisté se běžně vyskytují v půdě, vodě a lidských a zvířecích organismech. Známá je antagonistická aktivita zástupců normální mikroflóry lidského tlustého střeva - bifidobakterií, laktobacilů, Escherichia coli aj., což jsou antagonisté hnilobné mikroflóry.
Mechanismus antagonistických vztahů je různorodý. Běžnou formou antagonismu je tvorba antibiotik – specifických metabolických produktů mikroorganismů, které inhibují vývoj mikroorganismů jiných druhů. Existují i další projevy antagonismu, např. vysoká rychlost reprodukce, produkce bakteriocinů, zejména kolicinů, produkce organických kyselin a dalších produktů, které mění pH média.
4.7. Mikroflóra rostlinných léčivých surovin, fytopatogenní mikroorganismy, mikrobiologická kontrola léčiv
Rostlinné léčivé suroviny mohou být kontaminovány mikroorganismy v procesu jejich výroby: k infekci dochází vodou, nesterilním lékárenským náčiním, vzduchem průmyslových prostor a rukama personálu. K inseminaci dochází také v důsledku normální mikroflóry rostlin a fytopatogenních mikroorganismů - patogenů chorob rostlin. Fytopatogenní mikroorganismy jsou schopny se šířit a infikovat velké množství rostlin.
Mikroorganismy, které se normálně vyvíjejí na povrchu rostlin, jsou epifyty (řecky epi – nahoře, fyton – rostlina). Neškodí, jsou antagonisty některých fytopatogenních mikroorganismů, rostou na úkor běžných rostlinných sekretů a organického znečištění rostlinných povrchů. Epifytická mikroflóra zabraňuje pronikání fytopatogenních mikroorganismů do rostlinných pletiv a tím posiluje imunitu rostlin. Největší počet epifytické mikroflóry tvoří gramnegativní bakterie Erwinia herbicola, které tvoří zlatožluté kolonie na maso-peptonovém agaru. Tyto bakterie jsou antagonisty původce měkké hniloby zeleniny. V normě se nacházejí i další bakterie - Pseudomonas fluorescens, méně často Bacillus mesentericus a malé množství plísní. Mikroorganismy se nacházejí nejen na listech, stoncích, ale i na semenech rostlin. Narušení povrchu rostlin a jejich semen přispívá k hromadění velkého množství prachu a mikroorganismů na nich. Složení rostlinné mikroflóry závisí na druhu, stáří rostliny, typu půdy a okolní teplotě. S nárůstem vlhkosti se počet epifytických mikroorganismů zvyšuje, s poklesem vlhkosti klesá.
V půdě, v blízkosti kořenů rostlin, je značné množství
Změny podmínek prostředí ovlivňují životně důležitou aktivitu mikroorganismů. fyzikální, chemické, biologické faktory prostředí může urychlit nebo zpomalit vývoj mikrobů, může změnit jejich vlastnosti nebo dokonce způsobit smrt.
Mezi faktory prostředí, které mají nejnápadnější vliv, patří vlhkost, teplota, kyselost a chemické složení prostředí, působení světla a další fyzikální faktory.
Vlhkost vzduchu
Mikroorganismy mohou žít a vyvíjet se pouze v prostředí s určitým obsahem vlhkosti. Voda je nezbytná pro všechny metabolické procesy mikroorganismů, pro normální osmotický tlak v mikrobiální buňce, pro udržení její životaschopnosti. Různé mikroorganismy mají různé požadavky na vodu. Bakterie jsou převážně hygrofilní, při vlhkosti prostředí pod 20% se jejich růst zastaví. U plísní je spodní hranice vlhkosti prostředí 15 % a při výrazné vlhkosti vzduchu je ještě nižší. Usazování vodní páry ze vzduchu na povrchu výrobku podporuje růst mikroorganismů.
S poklesem obsahu vody v médiu se růst mikroorganismů zpomaluje a může se úplně zastavit. Suché potraviny lze proto skladovat mnohem déle než potraviny s vysokým obsahem vlhkosti. Sušení potravin umožňuje uchovávat potraviny při pokojové teplotě bez chlazení.
Některé mikroby jsou velmi odolné vůči sušení a některé bakterie a kvasinky mohou při sušení přežít až měsíc nebo déle. Spory bakterií a plísní zůstávají životaschopné v nepřítomnosti vlhkosti po desítky a někdy i stovky let.
Teplota
Teplota je nejdůležitějším faktorem pro vývoj mikroorganismů. Pro každý z mikroorganismů existuje minimální, optimální a maximální teplotní režim pro růst. Podle této vlastnosti se mikroby dělí do tří skupin:
- psychrofilové - mikroorganismy, které dobře rostou při nízkých teplotách s minimem při -10-0 °C, optimum při 10-15 °C;
- mezofilové - mikroorganismy, u kterých je optimální růst pozorován při 25-35 °C, minimum - při 5-10 °C, maximum - při 50-60 °C;
- teplomilné - mikroorganismy, které dobře rostou při relativně vysokých teplotách s optimálním růstem při 50-65 °C, maximálně při teplotách nad 70 °C.
Většina mikroorganismů patří mezi mezofily, pro jejichž vývoj je optimální teplota 25-35 °C. Proto skladování potravinářských výrobků při této teplotě vede k rychlému množení mikroorganismů v nich a ke znehodnocení výrobků. Některé mikroby s významnou akumulací v potravinách mohou vést k otravě potravinami. Patogenní mikroorganismy, tzn. vzdorný infekční choroby lidé jsou také mezofilní.
Nízké teploty zpomalují růst mikroorganismů, ale nezabíjejí je. V chlazených potravinách je růst mikroorganismů pomalý, ale pokračuje. Při teplotách pod 0 °C se většina mikrobů přestává množit, tzn. při zmrazení potravin se růst mikrobů zastaví, některé z nich postupně odumírají. Bylo zjištěno, že při teplotách pod 0 °C většina mikroorganismů upadá do stavu podobného anabióze, zachovává si životaschopnost a pokračuje ve svém vývoji, když teplota stoupá. Tato vlastnost mikroorganismů by měla být zohledněna při skladování a dalším kulinářském zpracování potravinářských výrobků. Například salmonely mohou být dlouhodobě skladovány v mraženém mase a po rozmrazení masa se za příznivých podmínek rychle nahromadí až do nebezpečného množství pro člověka.
Při vystavení vysokým teplotám, překračujícím maximální odolnost mikroorganismů, dochází k jejich smrti. Bakterie, které nemají schopnost tvořit spory, umírají při zahřátí ve vlhkém prostředí na 60-70 °C po 15-30 minutách, na 80-100 °C - po několika sekundách nebo minutách. Bakteriální spory jsou mnohem odolnější vůči teplu. Jsou schopny odolat 100 °C po dobu 1-6 hodin, při teplotě 120-130 °C bakteriální spory odumírají ve vlhkém prostředí za 20-30 minut. Spóry plísní jsou méně odolné vůči teplu.
Tepelná kulinářská úprava potravinářských výrobků ve veřejném stravování, pasterizace a sterilizace výrobků v potravinářském průmyslu vedou k částečné nebo úplné (sterilizační) smrti vegetativních buněk mikroorganismů.
Během pasterizace je potravinářský produkt vystaven minimálnímu teplotnímu efektu. V závislosti na teplotním režimu se rozlišuje nízká a vysoká pasterizace.
Nízká pasterizace se provádí při teplotě nepřesahující 65-80 ° C, po dobu nejméně 20 minut, aby byla lépe zaručena bezpečnost produktu.
Vysoká pasterizace je krátkodobé (ne déle než 1 minutu) vystavení pasterizovaného produktu teplotě nad 90 °C, která vede k odumírání patogenní mikroflóry bez výtrusů a zároveň nemá za následek výrazné změny v přirozených vlastnostech pasterizovaných produktů. Pasterizované potraviny nelze skladovat bez chlazení.
Sterilizace zahrnuje uvolnění produktu ze všech forem mikroorganismů, včetně spór. Sterilizace konzervovaných potravin se provádí ve speciálních zařízeních - autoklávech (pod tlakem páry) při teplotě 110-125 ° C po dobu 20-60 minut. Sterilizace poskytuje možnost dlouhodobého skladování konzervovaných potravin. Mléko je sterilizováno ultravysokou teplotou (při teplotách nad 130 °C) během několika sekund, což vám umožní ušetřit všechny prospěšné vlastnosti mléko.
Reakce prostředí
Životně důležitá aktivita mikroorganismů závisí na koncentraci vodíkových (H +) nebo hydroxylových (OH -) iontů v substrátu, na kterém se vyvíjejí. Pro většinu bakterií je nejvýhodnější neutrální (pH asi 7) nebo mírně zásadité prostředí. Plísně a kvasinky dobře rostou v mírně kyselém prostředí. Vysoká kyselost prostředí (pH pod 4,0) brzdí rozvoj bakterií, ale plísně mohou růst i v kyselejším prostředí. Potlačení růstu hnilobných mikroorganismů při acidifikaci média má praktické využití. Přídavek kyseliny octové se používá při moření produktů, což zabraňuje procesům rozkladu a umožňuje šetřit potraviny. Kyselina mléčná vznikající při fermentaci také inhibuje růst hnilobných bakterií.
Koncentrace soli a cukru
Kuchyňská sůl a cukr se již dlouho používají ke zvýšení odolnosti potravin vůči mikrobiálnímu kažení a ke zlepšení konzervace potravin.
Některé mikroorganismy vyžadují pro svůj vývoj vysoké koncentrace soli (20 % a více). Říká se jim slanomilní neboli halofilové. Mohou zkazit slaná jídla.
Vysoké koncentrace cukru (nad 55-65%) zastavují množení většiny mikroorganismů, toho se využívá při přípravě džemu, džemu nebo marmelády z ovoce a bobulovin. Tyto produkty však mohou kazit i osmofilní plísně nebo kvasinky.
Světlo
Některé mikroorganismy potřebují světlo pro normální vývoj, ale pro většinu z nich je to škodlivé. Ultrafialové sluneční paprsky mají baktericidní účinek, to znamená, že při určitých dávkách záření vedou ke smrti mikroorganismů. Baktericidní vlastnosti ultrafialových paprsků rtuťových výbojek se používají k dezinfekci vzduchu, vody a některých potravinářských výrobků. Infračervené paprsky mohou také způsobit smrt mikrobů v důsledku tepelné expozice. Dopad těchto paprsků se využívá při tepelném zpracování výrobků. Negativní vliv na mikroorganismy mohou mít elektromagnetická pole, ionizující záření a další fyzikální faktory prostředí.
Chemické faktory
Některé chemikálie mohou mít škodlivý účinek na mikroorganismy. Baktericidní chemikálie se nazývají antiseptika. Patří sem dezinfekční prostředky (chlór, chlornany atd.) používané v lékařství, potravinářství a podnicích veřejného stravování.
Některá antiseptika se používají jako přísady do jídla(kyseliny sorbové a benzoové atd.) při výrobě šťáv, kaviáru, krémů, salátů a dalších produktů.
Biologické faktory
Antagonistické vlastnosti některých se vysvětlují schopností je izolovat životní prostředí látky s antimikrobiálním (bakteriostatickým, baktericidním nebo fungicidním) účinkem - antibiotika. Antibiotika produkují především plísně, vzácně bakterie, mají svůj specifický účinek na určité druhy bakterií nebo plísní (fungicidní působení). Antibiotika se používají v lékařství (penicilin, chloramfenikol, streptomycin aj.), v chovu zvířat jako přísada do krmiv a v potravinářském průmyslu ke konzervaci potravin (nisin).
Fytoncidy mají antibiotické vlastnosti – látky nacházející se v mnoha rostlinách a potravinách (cibule, česnek, ředkvičky, křen, koření atd.). Mezi fytoncidy patří silice, antokyany a další látky. Jsou schopny způsobit smrt patogenních mikroorganismů a hnilobných bakterií.
Vaječný bílek, rybí kaviár, slzy, sliny obsahují lysozym, antibiotickou látku živočišného původu.