HPLC tekniğini uygulamak için kaç kromatograma ihtiyaç vardır. Kurs: Doğal ve atık su kirleticilerinin yüksek performanslı sıvı kromatografisi
"Doğal ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi atıksu»
giriiş
Bölüm 1. Sıvı kromatografi yöntemlerinin temel kavramları ve sınıflandırılması
1.1 Sıvı kromatografisi için aparat
Bölüm 2. HPLC'nin özü
2.1 Uygulama
Bölüm 3. Nesnelerin analizinde HPLC kullanma örnekleri çevre
Bölüm 4 HPLC Enstrümantasyon
Edebiyat
Başvuru
giriiş
Kromatografik Yöntemler genellikle tanımlama ve miktar tayini için vazgeçilmezdir organik madde benzer bir yapıya sahip. Çevresel kirleticilerin rutin analizi için en yaygın olarak kullanılanları gaz ve yüksek performanslı sıvı kromatografisidir. İçme ve atık sulardaki organik kirleticilerin gaz kromatografik analizi, başlangıçta dolgulu kolonların kullanımına dayanıyordu, daha sonra kuvars kılcal kolonlar da yaygınlaştı. Kılcal kolonların iç çapı genellikle 0.20-0.75 mm, uzunluk - 30-105 m'dir.Sudaki kirleticilerin analizinde optimum sonuçlar, çoğunlukla, fenil içeriğine sahip metilfenil silikonlardan yapılmış farklı film kalınlıklarına sahip kılcal kolonlar kullanıldığında elde edilir. 5 ve %50'lik gruplar . Numune enjeksiyon sistemi, kapiler kolonların kullanıldığı kromatografik tekniklerde genellikle hassas bir nokta haline gelir. Örnek enjeksiyon sistemleri iki gruba ayrılabilir: evrensel ve seçici. Üniversal olanlar, akışı bölen ve bölmeyen enjeksiyon sistemlerini, kolona "soğuk" enjeksiyonu ve sıcaklık programlamalı buharlaştırmayı içerir. Seçici enjeksiyon, ara yakalama, üst boşluk analizi vb. ile temizleme kullanır. Üniversal enjeksiyon sistemlerini kullanırken, numunenin tamamı seçici enjeksiyonla kolona girer, sadece belirli bir fraksiyon verilir. Kolona giren fraksiyon sadece uçucu maddeler içerdiğinden ve teknik tamamen otomatikleştirilebildiğinden seçici enjeksiyonla elde edilen sonuçlar önemli ölçüde daha doğrudur.
Kirletici izlemede kullanılan gaz kromatografik dedektörler genellikle mobil fazdaki her bir bileşene yanıt veren evrensel dedektörler ve benzer özelliklere sahip belirli bir madde grubunun mobil fazdaki varlığına tepki veren seçici dedektörler olarak ikiye ayrılır. kimyasal özellikler. Evrensel olanlar alev iyonizasyonu, atomik emisyon, kütle spektrometrik dedektörleri ve kızılötesi spektrometriyi içerir. Su analizinde kullanılan seçici dedektörler elektron yakalama (halojen atomu içeren maddelere seçici), termiyonik (azot ve fosfor içeren bileşiklere seçici), fotoiyonizasyon (aromatik hidrokarbonlara seçici), elektrolitik iletkenlik dedektörü (halojen içeren bileşiklere seçici) , kükürt ve azot atomları). Minimum tespit edilebilir madde miktarı nanogramdan saniyede pikograma kadar değişir.
Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi(HPLC) belirlemek için ideal yöntemdir. Büyük bir sayı gaz kromatografisi kullanılarak analiz edilemeyen termal olarak kararsız bileşikler. Şu anda, metil karbonatlar ve organofosforlu böcek öldürücüler ve diğer uçucu olmayan maddeler dahil olmak üzere modern tarım kimyasalları, genellikle sıvı kromatografisi ile analiz nesneleri haline gelmektedir. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC), çevresel izlemede kullanılan diğer yöntemler arasında popülerlik kazanmaktadır, çünkü aynı zamanda numune hazırlamanın otomatikleştirilmesi açısından parlak umutları vardır.
BÖLÜM 1. TEMEL KAVRAMLAR VE SIVI KROMATOGRAFİSİ YÖNTEMLERİNİN SINIFLANDIRILMASI
Sıvı kromatografisi, sabit faz desteğinin türüne bağlı olarak birkaç sınıfa ayrılır. Kağıt ve ince tabaka kromatografisinin basit enstrümantasyonu, bu yöntemlerin analitik uygulamada yaygın olarak kullanılmasına yol açmıştır. Bununla birlikte, kolon sıvı kromatografisinin büyük olanakları, bu klasik yöntem için ekipmanın geliştirilmesini teşvik etti ve HPLC'nin hızlı bir şekilde tanıtılmasına yol açtı. Eluentin kolondan yüksek basınç altında geçirilmesi, ince bir şekilde dağılmış bir sorbent kullanılması nedeniyle analiz hızını keskin bir şekilde artırmayı ve ayırma verimliliğini önemli ölçüde artırmayı mümkün kılmıştır. HPLC yöntemi şu anda organik bileşiklerin karmaşık karışımlarını izole etmeyi, nicel ve nitel olarak analiz etmeyi mümkün kılmaktadır.
Ayrılan maddenin (elüat) durağan faz ile etkileşim mekanizmasına göre, adsorpsiyon, dağılım, iyon değişimi, boyut dışlama, iyon çifti, ligand değişimi ve afinite kromatografisi ayırt edilir.
adsorpsiyon kromatografisi. Adsorpsiyon kromatografisi ile ayırma, ayrılacak maddenin alüminyum oksit veya silika jel gibi yüzeyde aktif polar merkezleri olan bir adsorban ile etkileşimi sonucunda gerçekleştirilir. Çözücü (eluent) polar olmayan bir sıvıdır. Sorpsiyon mekanizması, sorbentin polar yüzeyi ile analiz edilen bileşenin moleküllerinin polar (veya polarize olabilen) bölgeleri arasındaki spesifik etkileşimden oluşur (Şekil 1).
Pirinç. 1. Adsorpsiyon sıvı kromatografisi.
bölme kromatografisi. Sıvı kromatografisinin dağıtıcı versiyonunda, bir madde karışımının ayrılması, karışmayan iki faz - eluent (hareketli faz) ve sorbent üzerinde bulunan faz (sabit faz) arasındaki dağılım katsayılarındaki fark nedeniyle gerçekleştirilir.
saat normal faz Bölme sıvı kromatografisi, bir sorbentin (çoğunlukla silika jel) yüzeyine aşılanmış polar olmayan bir eluent ve polar gruplar kullanır. Nitril, amino grubu vb. gibi polar gruplar içeren ikameli alkilklorosilanlar, silika jel yüzey değiştiricileri (bağlı fazlar) olarak kullanılır (Şekil 2). Bağlı fazların kullanımı, sabit fazın yüzeyinin sorpsiyon özelliklerini hassas bir şekilde kontrol etmeyi ve yüksek ayırma verimi elde etmeyi mümkün kılar.
Pirinç. 2. Bağlı fazlı bölme kromatografisi (normal faz varyantı).
Ters evre sıvı kromatografisi, sorbent yüzeyine aşılanmış polar eluent ve polar olmayan gruplar (uzun alkil zincirleri) arasındaki karışım bileşenlerinin dağılımına dayanır (Şekil 3).
Pirinç. 3. Bağlı fazlı bölme kromatografisi (ters faz versiyonu).
Daha az yaygın olarak kullanılan, bir sıvı sabit fazın sabit bir desteğe uygulandığı, destekli faz sıvı kromatografisinin bir çeşididir.
Özel (jel nüfuz eden) Kromatografi, sorbentin gözeneklerinde bulunan solvent ile partikülleri arasında akan solvent arasındaki moleküllerin dağılımı nedeniyle maddelerin ayrılmasının meydana geldiği sıvı kromatografisinin bir çeşididir.
afin Kromatografi, proteinlerle seçici olarak kompleksler (konjugatlar) oluşturan bir sorbentin (sentetik reçine) yüzeyine aşılanmış maddelerle (antijenler) ayrılmış proteinlerin (antikorların) spesifik etkileşimlerine dayanır.
İyon değiştirme, iyon çifti, ligand değiştirme kromatografisi esas olarak inorganik analizlerde kullanılır.
Kromatografik ayırmanın temel parametreleri.
Kromatografik ayırmanın ana parametreleri, karışım bileşeninin alıkonma hacmi ve alıkonma süresidir (Şekil 4).
Tutma süresi tR, numunenin kolona enjekte edildiği andan karşılık gelen zirvenin maksimumuna ulaşılana kadar geçen süredir. Tutma süresini eluent hacim hızı F ile çarparak, tutma hacmi VR'yi elde ederiz:
Düzeltilmiş alıkonma süresi, emilebilir olmayan bileşenin tepe noktasının karşılık gelen bileşiğin zirvesine göründüğü andan itibaren geçen süredir:
tR" = tR - t0 ;
Normalleştirilmiş veya düzeltilmiş alıkonma hacmi, kolon ölü hacmi V0 için düzeltilmiş alıkonma hacmidir, yani emilebilir olmayan bileşenin alıkonma hacmi:
VR" = VR - V0;
Tutma özelliği aynı zamanda sabit fazdaki maddenin kütlesinin hareketli fazdaki maddenin kütlesine oranı olarak tanımlanan k" kapasitans faktörüdür: k" = mn / mp;
k" değerini kromatogramdan belirlemek kolaydır:
Kromatografik ayırmanın en önemli parametreleri verimliliği ve seçiciliğidir.
Teorik plakaların (HETP) yüksekliği ile ölçülen ve sayılarıyla (N) ters orantılı olarak kolonun verimliliği daha yüksektir, aynı alıkonma zamanında ortaya çıkan maddenin zirvesi ne kadar dar olursa. Verimlilik değeri, aşağıdaki formül kullanılarak kromatogramdan hesaplanabilir:
N = 5.54. (tR / 1/2) 2 ,
nerede tr- bekleme süresi,
w 1/2 - yarım yükseklikte tepe genişliği
Kolon başına teorik plaka sayısını, kolon uzunluğunu L ve ortalama sorbent tane çapı dc'yi bilerek, teorik plaka eşdeğer yüksekliği (HETP) ve azaltılmış yükseklik (PETP) değerlerini elde etmek kolaydır:
HETP = L/N PHETP = HETP/d c
Bu özellikler, farklı tipteki kolonların verimliliğini karşılaştırmayı, sorbentin kalitesini ve kolonları doldurma kalitesini değerlendirmeyi mümkün kılar.
İki maddenin ayrılmasının seçiciliği denklem ile belirlenir:
İki bileşenli bir karışımın ayrılması düşünüldüğünde, ayırma derecesi RS de önemli bir parametredir:
;
RS değeri 1.5'e eşit veya daha büyükse tepe noktaları çözümlenmiş olarak kabul edilir.
Ana kromatografik parametreler, çözünürlük için aşağıdaki denklemi ilişkilendirir:
;
Ayırma seçiciliğini belirleyen faktörler şunlardır:
1) sorbentin kimyasal yapısı;
2) çözücünün ve değiştiricilerinin bileşimi;
3) ayrılacak karışımın bileşenlerinin kimyasal yapısı ve özellikleri;
4) kolon sıcaklığı
1.1 Sıvı kromatografisi için aparat
Modern sıvı kromatografisinde, en basit sistemlerden çeşitli ek cihazlarla donatılmış üst düzey kromatograflara kadar değişen derecelerde karmaşıklığa sahip cihazlar kullanılır.
Şek. Şekil 4, herhangi bir kromatografik sistemde mevcut olan, şu veya bu biçimde minimum gerekli bileşen setini içeren bir sıvı kromatografının blok diyagramını göstermektedir.
Pirinç. 4. Bir sıvı kromatografın blok diyagramı.
Pompa (2), sabit bir solvent akışı oluşturacak şekilde tasarlanmıştır. Tasarımı öncelikle sistemdeki çalışma basıncı tarafından belirlenir. 10-500 MPa aralığında çalışması için pistonlu (şırınga) veya pistonlu tip pompalar kullanılmaktadır. İlkinin dezavantajı, eluent ile doldurmak için periyodik duraklara ihtiyaç duyulmasıdır ve ikincisi, tasarımın büyük karmaşıklığı ve sonuç olarak yüksek fiyattır. 1-5 MPa'lık düşük çalışma basınçlarına sahip basit sistemler için pahalı olmayan peristaltik pompalar başarıyla kullanılır, ancak sabit bir basınç ve akış hızı elde etmek zor olduğu için kullanımları hazırlık görevleriyle sınırlıdır.
Enjektör (3), ayrılan bileşenlerin karışımının bir örneğinin kolona yeterince yüksek bir tekrarlanabilirlikle enjekte edilmesini sağlar. Basit "akış durdurma" numune enjeksiyon sistemleri, pompanın durdurulmasını gerektirir ve bu nedenle Reodyne'in döngü pipetlerinden daha az uygundur.
HPLC kolonları (4), yüksek basınca dayanabilen kalın duvarlı paslanmaz çelik borulardır. Kolonun bir sorbent ile doldurulmasının yoğunluğu ve homojenliği önemli bir rol oynar. Düşük basınçlı sıvı kromatografisi için kalın duvarlı cam kolonlar başarıyla kullanılmaktadır. Sıcaklık sabitliği termostat (5) ile sağlanmaktadır.
Sıvı kromatografisi için dedektörler (6), içinde akan eluentin bazı özelliklerinin sürekli olarak ölçüldüğü bir akış hücresine sahiptir. Genel amaçlı dedektörlerin en popüler türleri, kırılma indisini ölçen refraktometreler ve sabit bir dalga boyunda (genellikle ultraviyole bölgesinde) bir çözücünün absorbansını ölçen spektrofotometrik dedektörlerdir. Refraktometrelerin avantajları (ve spektrofotometrelerin dezavantajları), kromofor grupları içermeyen, belirlenmekte olan bileşik tipine karşı düşük hassasiyet içerir. Öte yandan, refraktometrelerin kullanımı izokratik sistemlerle sınırlıdır (sabit bir eluent bileşimi ile), bu nedenle bu durumda bir çözücü gradyanının kullanılması mümkün değildir.
Çevre kirletici analizinde en yaygın olarak kullanılan HPLC kolonları 25 cm uzunluğunda ve 4.6 mm iç çapındadır ve oktadesil grupları ile aşılanmış 5-10 µm küresel silika jel partikülleri ile doldurulmuştur. AT son yıllar daha küçük parçacıklarla dolu daha küçük bir iç çapa sahip sütunlar ortaya çıktı. Bu tür kolonların kullanılması solvent tüketimini ve analiz süresini azaltır, hassasiyeti ve ayırma verimini arttırır ve ayrıca kolonları spektral dedektörlere bağlama problemini kolaylaştırır. 3,1 mm iç çapa sahip kolonlar, servis ömrünü uzatmak ve analizlerin tekrarlanabilirliğini iyileştirmek için bir güvenlik kartuşu (ön kolon) ile donatılmıştır.
Modern HPLC cihazlarında dedektörler olarak, genellikle bir diyot dizisi üzerinde bir UV dedektörü, floresan ve elektrokimyasal dedektörler kullanılır.
Pratik çalışmada, ayırmanın genellikle bir değil, aynı anda birkaç mekanizma tarafından gerçekleştiği akılda tutulmalıdır. Bu nedenle, dışlama ayırma, adsorpsiyon etkileri, adsorpsiyon - dağıtım ve bunun tersi ile karmaşık olabilir. Bu durumda, iyonizasyon derecesi, baziklik veya asitlik, moleküler ağırlık, polarize edilebilirlik ve diğer parametreler açısından numunedeki maddeler arasındaki fark ne kadar büyük olursa, bu tür maddeler için farklı bir ayırma mekanizmasının olasılığı o kadar yüksek olur.
Pratikte, durağan fazın polar olmadığı, mobil fazın polar olduğu (yani, "düz faz" kromatografisinin tersi) "ters faz" (bölme) kromatografisi en yaygın hale gelmiştir.
Dünya çapındaki çoğu laboratuvarda, 16 öncelikli PAH grubu HPLC veya CMS ile analiz edilir.
BÖLÜM 2. HPLC'NİN ÖZÜ
Yüksek performanslı sıvı kromatografisinde (HPLC), kromatografik kolonda meydana gelen proseslerin doğası genellikle gaz kromatografisindeki proseslerle aynıdır. Fark, yalnızca bir sıvının sabit bir faz olarak kullanılmasındadır. Sıvı hareketli fazların yüksek yoğunluğu ve kolonların yüksek direnci nedeniyle, gaz ve sıvı kromatografisi enstrümantasyonda büyük farklılıklar gösterir.
HPLC'de mobil fazlar olarak genellikle saf çözücüler veya bunların karışımları kullanılır.
Sıvı kromatografisinde eluent olarak adlandırılan bir saf solvent (veya solvent karışımları) akışı oluşturmak için kromatograf hidrolik sisteminin bir parçası olan pompalar kullanılır.
Adsorpsiyon kromatografisi, bir maddenin yüzeyde aktif merkezleri olan silika jel veya alüminyum oksit gibi adsorbanlarla etkileşimi sonucunda gerçekleştirilir. Farklı numune moleküllerinin adsorpsiyon merkezleriyle etkileşime girme yeteneğindeki fark, hareketli faz ile kolon boyunca hareket etme sürecinde bölgelere ayrılmalarına yol açar. Bu durumda elde edilen bileşen bölgelerinin bölünmesi, hem çözücü hem de adsorban ile etkileşime bağlıdır.
Farklı hacimlere, yüzeylere ve gözenek çaplarına sahip silika jel adsorbanları, HPLC'de en büyük uygulamayı bulur. Alüminyum oksit ve diğer adsorbanlar çok daha az kullanılır. Bunun ana nedeni:
HPLC için tipik olan yüksek basınçlarda paketlemeye ve kullanıma izin vermeyen yetersiz mekanik dayanım;
alüminyum oksit ile karşılaştırıldığında silika jel, daha geniş bir gözeneklilik, yüzey ve gözenek çapı aralığına sahiptir; alüminyum oksidin önemli ölçüde daha yüksek katalitik aktivitesi, numune bileşenlerinin ayrışması veya bunların geri döndürülemez kimyasal soğurulması nedeniyle analiz sonuçlarının bozulmasına yol açar.
HPLC dedektörleri
Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC), türevleri şeklinde bile olsa, herhangi bir nedenle gaz kromatografisi için uygun bir forma dönüştürülemeyen polar uçucu olmayan maddeleri tespit etmek için kullanılır. Bu tür maddeler özellikle sülfonik asitleri, suda çözünür boyaları ve fenil-üre türevleri gibi bazı pestisitleri içerir.
Dedektörler:
UV - diyot dizisi dedektörü. Fotodiyotların "matrisi" (iki yüzden fazla vardır) sürekli olarak spektrumun UV ve görünür bölgesindeki sinyalleri kaydeder, böylece tarama modunda UV-B spektrumlarının kaydedilmesini sağlar. Bu, özel bir hücreden hızla geçen bileşenlerin bozulmamış spektrumlarını yüksek hassasiyette sürekli olarak kaydetmeyi mümkün kılar.
Zirvenin "saflığı" hakkında bilgi sağlamayan tek dalga boyu algılama ile karşılaştırıldığında, diyot dizisinin tam spektrumunu karşılaştırma yeteneği, çok daha yüksek bir kesinlik derecesine sahip bir tanımlama sonucu sağlar.
Floresan dedektörü. Floresan dedektörlerin büyük popülaritesi, çok yüksek seçicilik ve hassasiyetten ve birçok çevresel kirleticinin floresan (örneğin, poliaromatik hidrokarbonlar) olması gerçeğinden kaynaklanmaktadır.
Kolayca oksitlenen veya indirgenen maddeleri tespit etmek için bir elektrokimyasal dedektör kullanılır: fenoller, merkaptanlar, aminler, aromatik nitro ve halojen türevleri, aldehitler, ketonlar, benzidinler.
PF'nin yavaş ilerlemesi nedeniyle kolondaki karışımın kromatografik olarak ayrılması uzun zaman alır. İşlemi hızlandırmak için kromatografi basınç altında gerçekleştirilir. Bu yönteme yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) denir.
Klasik sıvı kolon kromatografisinde kullanılan ekipmanın modernizasyonu, onu gelecek vaat eden ve modern analiz yöntemlerinden biri haline getirmiştir. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi, hem düşük hem de yüksek moleküler ağırlıklı uçucu olmayan, ısıl kararsız bileşiklerin ayrılması, hazırlayıcı olarak izole edilmesi ve kalitatif ve kantitatif analizinin yapılması için uygun bir yöntemdir.
Bu yöntemde kullanılan sorbent tipine bağlı olarak, 2 çeşit kromatografi kullanılır: polar olmayan bir eluent kullanan polar bir sorbent üzerinde (doğrudan faz seçeneği) ve polar bir eluent kullanan polar olmayan bir sorbent üzerinde - sözde ters -fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi (RPHLC).
Eluent, eluent'e geçtiğinde, RPHLC koşulları altındaki denge, polar sorbentler ve susuz PF'lerin koşullarına göre birçok kez daha hızlı kurulur. Bunun bir sonucu olarak, su ve su-alkollü eluentlerle çalışma kolaylığının yanı sıra RPHLC artık büyük popülerlik kazanmıştır. Çoğu HPLC analizi bu yöntem kullanılarak gerçekleştirilir.
Dedektörler. Ayrı bir bileşenin sütunundan çıktının kaydı, bir dedektör kullanılarak gerçekleştirilir. Kayıt için, mobil fazdan gelen ve karışım bileşeninin niteliği ve miktarı ile ilgili herhangi bir analitik sinyaldeki değişikliği kullanabilirsiniz. Sıvı kromatografisi, mevcut çözeltinin ışık absorpsiyonu veya ışık emisyonu (fotometrik ve florimetrik dedektörler), kırılma indisi (refraktometrik dedektörler), potansiyel ve elektriksel iletkenlik (elektrokimyasal dedektörler) vb. gibi analitik sinyalleri kullanır.
Sürekli olarak algılanan sinyal, kaydedici tarafından kaydedilir. Kromatogram, karışımın tek tek bileşenleri kolondan çıktığında oluşturulan, kayıt cihazı bandına kaydedilen detektör sinyalleri dizisidir. Karışımın ayrılması durumunda, harici kromatogramda ayrı ayrı pikler görülebilir. Zirvenin kromatogram üzerindeki konumu, maddenin tanımlanması amacıyla, tepenin yüksekliği veya alanı - nicel belirleme amacıyla kullanılır.
2.1 Uygulama
HPLC, aşağıdaki kimyasal analiz alanlarında en geniş uygulamayı bulur (HPLC'nin neredeyse hiç rekabeti olmadığı analiz nesneleri vurgulanır):
· Gıda kalite kontrolü - tonik ve aroma katkı maddeleri, aldehitler, ketonlar, vitaminler, şekerler, boyalar, koruyucular, hormonlar, antibiyotikler, triazin, karbamat ve diğer pestisitler, mikotoksinler, nitrosoaminler, polisiklik aromatik hidrokarbonlar vb.
· Çevre koruma - fenoller, organik nitro bileşikleri, mono- ve polisiklik aromatik hidrokarbonlar, bir dizi pestisit, ana anyonlar ve katyonlar.
· Kriminalistik - ilaçlar, organik patlayıcılar ve boyalar, güçlü ilaçlar.
· İlaç endüstrisi - steroid hormonları, hemen hemen tüm organik sentez ürünleri, antibiyotikler, polimer müstahzarları, vitaminler, protein müstahzarları.
İlaç - hastalıkların teşhisinde biyolojik sıvılarda (amino asitler, pürinler ve pirimidinler, steroid hormonları, lipidler) listelenen biyokimyasal ve tıbbi maddeler ve bunların metabolitleri, bireysel dozajları için ilaçların vücuttan atılma oranını belirleme .
· Tarım- Uygulanan gübre miktarının belirlenmesi için topraklarda nitrat ve fosfat tayini, yemin besin değerinin (amino asitler ve vitaminler) tespiti, toprak, su ve tarım ürünlerinde pestisit analizleri.
Biyokimya, biyoorganik kimya, genetik mühendisliği, biyoteknoloji - şekerler, lipidler, steroidler, proteinler, amino asitler, nükleositler ve bunların türevleri, vitaminler, peptitler, oligonükleotitler, porfirinler vb.
· Organik kimya - tüm kararlı organik sentez ürünleri, boyalar, ısıya dayanıklı bileşikler, uçucu olmayan bileşikler; inorganik kimya (hemen hemen tüm çözünür bileşikler, iyonlar ve kompleks bileşikler şeklinde).
· Üretimin tüm aşamalarında gıda ürünleri, alkollü ve alkolsüz içecekler, içme suları, ev kimyasalları, parfümlerin kalite kontrolü ve güvenliği;
insan kaynaklı bir afet veya acil durum sahasındaki kirliliğin niteliğinin belirlenmesi;
narkotik, güçlü, zehirli ve patlayıcılar;
varlığın belirlenmesi zararlı maddeler(polisiklik ve diğer aromatik hidrokarbonlar, fenoller, pestisitler, organik boyalar, ağır, alkali ve toprak alkali metal iyonları) sıvı atıklarda, hava emisyonlarında ve işletmelerden ve canlı organizmalarda katı atıklarda;
· organik sentez, petrol ve kömür işleme, biyokimyasal ve mikrobiyolojik üretim süreçlerinin izlenmesi;
gübreleme için toprak kalitesi, toprakta, suda ve ürünlerde pestisit ve herbisitlerin varlığının yanı sıra yemin besin değerinin analizi; karmaşık araştırma analitik görevleri; mikro miktarda ultra saf madde elde etmek.
BÖLÜM 3. ÇEVRESEL OBJELERİN ANALİZİNDE HPLC KULLANIM ÖRNEKLERİ
HPLC - çevresel nesnelerdeki PAH'ları izlemek için bir yöntem
1. tehlike sınıfının ekotoksik maddeleri olan polisiklik aromatik hidrokarbonlar (PAH'ler) için son derece düşük seviyelerde izin verilen maksimum konsantrasyonlar (MAC'ler) belirlenmiştir. doğal nesneler. MPC düzeyinde ve altında PAH'ların belirlenmesi, çok karmaşık analitik görevlerden biridir ve bunları çözmek için yüksek teknoloji analiz yöntemleri (GC-MS, GC, HPLC) kullanılır. İzleme için bir yöntem seçerken, dikkate alınan ana özelliklere ek olarak - duyarlılık ve seçicilik, ifade ve ekonomi eklenir, çünkü. izleme, seri analizi içerir. Küçük çaplı kısa kolonlarda HPLC varyantı büyük ölçüde belirtilen gereksinimleri karşılar. Bu yöntemi kullanarak, yazarlar benzo[a]piren'i üç doğal ortamda izlemek için yöntemler geliştirdiler ve onayladılar: aerosol, kar örtüsü ve yüzey suları. Yöntemler şu şekilde karakterize edilir: PAH'ların organik çözücüler ile ekstraksiyonu ve ekstrakt konsantrasyonu dahil olmak üzere basit birleştirilmiş numune hazırlama, konsantre bir ekstraktın kromatografik bir sütuna doğrudan eklenmesi, spektrumun UV bölgesinde çok dalga boylu fotometrik algılamanın kullanılması, tanımlama İki parametre, alıkonma süresi ve spektral oran kullanılarak kromatogramlarda PAH tepe noktalarının oranı. 0,3 ila 450 ng/m ila 50 μg / m2 konsantrasyon aralığında aerosolde benz[a]piren belirlenirken toplam hata %10'u geçmez. Öncelikli PAH'ların (12 bileşiğe kadar) eşzamanlı belirlenmesi ve analitlerin homojen olmayan piklerinin kaydedilmesi durumunda, ekstrenin mobil fazın seçiciliğinde, algılama dalga boyunda ve kolon sıcaklığında bir değişiklikle yeniden ayrılması önerildi, belirlenmekte olan PAH'ın bireysel özellikleri dikkate alınarak.
1 . Ortam hava kalitesi. Benzo[a]piren kütle konsantrasyonu. HPLC yöntemiyle ölçüm gerçekleştirme prosedürü. Onay sertifikası MVI No. 01-2000.
2 . Yüzey ve arıtılmış atık su kalitesi. Benzo[a]piren kütle konsantrasyonu. HPLC yöntemiyle ölçüm gerçekleştirme prosedürü. Onay belgesi MVI No. 01-2001.
3 . Kar örtüsü kalitesi. Benzo[a]piren kütle konsantrasyonu. HPLC yöntemiyle ölçüm gerçekleştirme prosedürü. Onay belgesi MVI No. 02-2001.
Haddelenmiş Bakır Pulunun Alüminotermik Geri Kazanımının Atıklarını Kullanarak Sulu Çözeltilerden Anilinin Giderilmesi
Hidrokarbonların atık sudan uzaklaştırılması sorunu acil bir iştir. Birçok kimya, petrokimya ve diğer endüstrilerde toksik maddeler olan anilin ve türevleri oluşur. Anilin oldukça toksik bir maddedir, MPC - 0.1 mg / m3. Anilin ve türevleri suda çözünür ve bu nedenle yerçekimi çökeltme ile uzaklaştırılamaz.
Organik kirleticilerden atık su arıtmanın en iyi yöntemlerinden biri, yenilenebilen (alüminosilikatlar, modifiye killer, ahşap, lifler, vb.) ve yenilenemeyen (aktif karbon, makro gözenekli polimerik malzemeler vb.) inorganik ve organik adsorbanların kullanılmasıdır. . ).
Rejenere adsorbanlar, farklı polaritedeki organik maddeleri sudan çıkarabilir. Etkili adsorban arayışı acil bir iştir.
Bu rapor, Yerevan Kablo Fabrikasının (OPMOERKZ) öğütülmüş bakır ölçeğinin anilin sorbentleri olarak kullanılması alanında yapılan bir çalışmanın sonuçlarını sunmaktadır.
Kromatografik çalışmalar bir HPLC kromatografı / yüksek performanslı sıvı kromatografisi / sistemleri (Waters 486 - dedektör, Waters 600S - kontrolör, Waters 626 - Pompa), incelenen sorbentlerle dolu 250 x 4 mm'lik bir kolonda, mobil faz hızı 1 üzerinde gerçekleştirilmiştir. Çalıştığımız çözücüler ml/m/mobil faz/, dedektör UV-254'tür. UV spektroskopik analizi, bir Specord-50 spektrofotometre üzerinde gerçekleştirildi, spektrumlar ASPECT PLUS bilgisayar programı kullanılarak elde edildi.
Tam olarak tartılmış sorbent kısımları, başlangıç konsantrasyonları değişen su içindeki belirli hacimlerdeki anilinlere ilave edildi. Karışım 6 saat boyunca iyice çalkalandı, ardından numune çökmeye bırakıldı. Adsorpsiyon yaklaşık 48 saatte tamamlanır Çökelen anilin miktarı UV spektrofotometrik ve kırılma analizi ile belirlendi.
İlk olarak, OPMOEPKZ'nin adsorpsiyon özellikleri, karbon tetraklorür içindeki bir çözeltiden anilinin uzaklaştırılması sırasında incelenmiştir. Anilinin en iyi sorbent 3'ü emdiği ortaya çıktı (tablo).
0.01-0.0001 mol/l konsantrasyonlarda anilin sulu çözeltileri için de ölçümler yapıldı. Tablo, 0,01 M'lik bir çözümle ilgili verileri gösterir.
20°C'de 0.01 M sulu anilin çözeltisinden çeşitli sorbentler tarafından anilin absorpsiyonu
Daha önce, belirtilen konsantrasyon aralıklarında adsorpsiyonun arttığı ve kırılma indisine doğrusal olarak bağlı olduğu bulunmuştu. Anilin miktarı, kırılma indeksine karşı molar konsantrasyon grafiğinden belirlendi ve hem sıvı kromatografisi hem de UV spektral analizi için düzeltildi.
Sorbent 3, sulu çözeltiler için en aktif olanıdır.Adsorbe edilen kirletici miktarı, ilk çözeltiye eklenen toplam kirletici miktarı ile nihai çözeltideki kalıntısı arasındaki fark olarak hesaplanmıştır.
Çevresel nesnelerde PAH'ları belirleme yöntemleri
Tipik olarak, PAH'ları belirlemek için gaz kromatografisi (GC) ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) yöntemleri kullanılır. kantitatif analiz için yeterli olan ana 16 PAH'ın ayrılması, ya gaz kromatografisinde kapiler kolonlar ya da HPLC'de kullanılan yüksek performanslı kolonlar kullanılarak elde edilir. On altı PAH'ın kalibrasyon karışımlarını iyi ayıran bir sütunun, incelenen örneklerde eşlik eden organik bileşiklerin arka planına karşı da iyi ayrılacaklarını garanti etmediği unutulmamalıdır.
Analizi basitleştirmek ve sonuca ulaşmak için Yüksek kalite Elde edilen sonuçlara göre, çoğu analitik prosedür, numunelerdeki diğer ilgili bileşik gruplarından PAH'ların ön izolasyonu (ayırma) aşamasını içerir. Bu amaçla kullanılan en yaygın yöntemler, silika jel veya alümina kullanımı gibi adsorpsiyon mekanizmaları kullanan sıvı-katı veya sıvı-sıvı sistemlerinde düşük basınçlı sıvı kromatografisidir, bazen Sephadex kullanılarak adsorpsiyon ve dışlama gibi karışık mekanizmalar kullanılır.
Numunelerin ön muamelesinin kullanılması, aşağıdakilerin etkisinden kaçınmayı mümkün kılar:
Alifatik hidrokarbonlar gibi tamamen polar olmayan bileşikler;
Orta ve güçlü polar bileşikler, örneğin ftalan, fenoller, polihidrik alkoller, asitler;
Örneğin reçineler gibi yüksek moleküler ağırlıklı bileşikler.
Yüksek performanslı sıvı kromatografisinde (HPLC) esas olarak iki tip dedektör kullanılır: bir florimetrik dedektör veya bir fotodiyot çubuk spektrofotometrik dedektör. Florimetrik tespitte PAH'ların tespit limiti çok düşüktür, bu da bu yöntemi özellikle eser miktarlarda poliaromatik bileşiklerin tespiti için uygun hale getirir. Bununla birlikte, klasik florimetrik dedektörler, incelenen bileşiğin yapısı hakkında neredeyse hiçbir bilgi sağlamaz. Modern tasarımlar, bireysel bileşiklerin karakteristiği olan floresan spektrumlarının kaydedilmesini mümkün kılar, ancak bunlar rutin ölçümlerin pratiğinde henüz yaygınlaşmamıştır. Fotodiyot hattına (PDL) sahip bir spektrofotometrik dedektör, UV ve görünür spektral aralıkta absorpsiyon spektrumlarının kaydedilmesini mümkün kılar, bu spektrumlar tanımlama için kullanılabilir. Benzer bilgiler, hızlı tarama dedektörleri kullanılarak elde edilebilir.
Bu PAH'ların ayrılması, tanımlanması ve nicelleştirilmesi için bir analitik teknik seçerken aşağıdaki koşullar dikkate alınmalıdır:
İncelenen örneklerde belirlenen içeriklerin düzeyi;
İlgili maddelerin sayısı;
Uygulanan analitik prosedür (ölçüm tekniği);
Seri ekipmanın olanakları.
İyon Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi ile Alkali Toprak Elementleri ve Magnezyum Tayini İçin Bir Yöntemin Geliştirilmesi
Su analizi problemlerinin çözümüne olanak sağlayan yöntemlerin geliştirilmesi ve iyileştirilmesi analitik kimyada önemli bir problemdir. Yüksek performanslı sıvı kromatografisinin geliştirilmesi yüksek basınç iyon değişim kromatografisinde iyon kromatografisi adı verilen yeni bir yönün gelişimini teşvik etti. İyon kromatografisi için sorbentlerin sentezi zordur, çünkü üzerlerinde oldukça fazla gereksinim vardır. Ticari olarak temin edilebilen yüksek performanslı katyon değiştiricilerin olmaması nedeniyle, bir değiştiricinin sentezlendiği dinamik olarak değiştirilmiş bir ters faz kullanıldı: N-heksadesil-N-dekanoil-para-amino-benoilsülfonik asit etil-diizopropilamonyum (DGDASC), burada katyon değişimi yapabilen SO3 - grubunu içeren hidrofobik amin. Değiştirici çözeltiyi geçtikten sonra, l = 260 nm'deki absorpsiyon, bir platoya ulaşan 6.4 birim optik yoğunluğa (° E) ulaştı. Hesaplanan iyon değiştirme kapasitesi 15,65 µmol'dür. Alkali toprak elementlerinin ve magnezyumun katyonları spektrumun UV bölgesinde absorbe etmediğinden, sentezlenen UV absorbe edici eluent 1,4-dipiridinyum bütan bromür (DPB bromür) kullanılarak dolaylı UV tespiti kullanıldı. Halojen iyonları kolonun çelik kısımlarını tahrip ettiğinden, 1,4-dipiridinyum bütanın bromür iyonu bir asetat iyonu ile değiştirildi. Kolon, eluent ile yıkandığında, değiştiricinin karşı iyonu olan etildiizopropilamonyum, UV emici iyon 1,4-dipiridinyumbutan ile değiştirilir. Katyonların ayrılması, "ölçek katlama" modunda 0,4 A ölçeğinde optimal dalga boyu l = 260 nm'de gerçekleştirildi; kaydedicinin polaritesi tersine çevrildi. Çalışılan tüm katyonların ayrılması, kompleks yapıcı bir katkı maddesi - oksalik asidin eklenmesiyle sağlandı. Mg 2+ , Ca 2+ , Sr 2+ , Ba 2+ tespit limitleri 8 μg/l'dir; 16 ug/l; 34 ug/l; 72 µg/l, sırasıyla. Seçilen koşullar altında, 10.6 +1.9 mg-iyon/l, Mg2+ -2.5 + mg-iyon/l olan Ca2+ içeriği musluk suyu analiz edildi. Tekrarlanabilirlik hatası Ca 2+ için %-2,2'yi ve Mg 2+ için %1.4'ü geçmez.
Çevredeki kadmiyum komplekslerinin analizi
Biyosferdeki ağır metallerin göç mekanizmalarını incelemek için, doğada metallerin varlığının kimyasal formları hakkında verilere ihtiyaç vardır. En çok birinin bileşiklerinin analizindeki zorluklar toksik metaller- kadmiyum - kararsız kompleksler oluşturması nedeniyle ve onları izole etmeye çalıştığınızda doğal dengeler bozulur. Bu çalışmada, topraktaki ve bitkilerdeki kadmiyum bileşikleri, ekstrelerin kromatografik olarak ayrılmasına ve ardından bileşenlerinin kimyasal analiz ile tanımlanmasına dayanan bir teknik kullanılarak incelenmiştir. Bu yaklaşım, yalnızca kadmiyumun kimyasal formlarını tanımlamayı değil, aynı zamanda çevresel nesnelerdeki dönüşümlerini izlemeyi de mümkün kıldı.
OH grupları karbonhidratlar ve polifenoller (flavonoidler dahil), C=O, fosfatlar, NH2 , NO2 , SH grupları biyosfer nesnelerinde kadmiyum ile koordine edilir. Bu çalışmanın amaçları doğrultusunda, bu bileşik sınıflarını temsil eden bir dizi model ligand derlenmiştir. Model ligandların suda çözünür kadmiyum tuzları ile etkileşimi UV spektroskopisi ve HPLC ile incelenmiştir.
Kadmiyum bileşiklerini izole etmek için özel olarak seçilmiş (Cd ile kompleks oluşturmayan) çözücüler ile ekstraksiyon kullanıldı. Bu şekilde kadmiyum, yakın kimyasal analogu çinko hariç tüm ağır metallerden ayrılabilir. Elde edilen ekstraktların kromatogramlarında kadmiyum ve çinko içeren pikler, ditizonat formundaki metallerin bağlanmasıyla tespit edildi. Çinkodan ayırmak için, pH 6-8'de Cd ve Zn komplekslerinin stabilitesindeki fark kullanıldı. İzole edilen Cd bileşikleri, elüsyon sırasında pH değişiklikleri ile HPLC ile tanımlandı. Toprak bileşenleri ve bitki dokuları ile kadmiyum bileşiklerinin analizi yapılmış ve topraktan kadmiyum alımındaki artışa tepki olarak bitkiler tarafından üretilen maddeler tespit edilmiştir. Flavonoidlerin, özellikle trisinin, tahıllarda koruyucu ajanlar, baklagillerde sisteinin alkoksi türevleri ve turpgillerden bitkilerde hem polifenoller hem de tiyoller olduğu gösterilmiştir.
BÖLÜM 4. HPLC EKİPMANI
DİZİLER ACCELA
Yeni ACCELA Ultra Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografı, geniş bir akış hızı ve basınç aralığında çalışabilir ve hem geleneksel kolonlarda tipik HPLC ayrımları hem de sorbent partikül boyutu 2 µm'den az olan kolonlarda ultra hızlı ve verimli ayrımlar sağlar. ultra yüksek basınçlar (1000 atm'den büyük).
Sistem, yüksek hızlı kromatografik ayrımlar sağlayan, 1000 atm'yi aşan basınçları ve sadece 65 µl'lik bir gecikme hacmi ile verebilen bir kuaterner gradyan inert pompa içerir. otomatik örnekleyici ACCELA 30 saniyelik bir numune enjeksiyon döngüsünde çalışabilir ve en yüksek enjeksiyon tekrarlanabilirliğini sağlar. Diyot Dizi Dedektörü Hızlandırılmış PDA minimize edilmiş akış hücre hacmi (2 µl) ile yüksek hızlı kromatografi için optimize edilmiştir, patentli LightPipe teknolojisini kullanır ve kusursuz bir kromatografi sistemi ve kolonlarla gelen simetrik tepe şeklini korur.
Sistem, dünyadaki en güçlü ve en iyi LC/MS sistemlerini oluşturmak için kütle spektrometreleriyle mükemmel bir şekilde eşleşir.
Tüm uygulamalar için Thermo Electron'dan temin edilebilen 1,9 µm UHP kolonları
DİZİLER TSP
HPLC cihazlarının modüler yapım ilkesi, müşterinin herhangi bir analitik problemi çözmek için ekipmanı esnek bir şekilde tamamlamasını sağlar ve değiştiklerinde, hızlı ve ekonomik olarak değiştirilebilir. Geniş modül yelpazesi, izokratikten dörtlü gradyana, mikro sütundan yarı hazırlayıcıya kadar pompaları, mevcut tüm dedektörleri, manuel enjektörlerden otomatik numune alıcılara kadar her türlü numuneyi işleme yeteneğine sahip numune enjeksiyon sistemlerini, ölçüm sonuçlarını işlemek ve yönetmek için güçlü bir yazılım içerir. Sistemin tüm modülleri. Tüm modüller CSA, TUF/GS, FCC(EMI), VDE (EMI), ISO-9000'e göre sertifikalandırılmıştır, kompakttırlar, modern bir tasarıma sahiptirler, kullanımı kolaydır, yerleşik bir ekran ile donatılmıştır ve kendi kendine tanı sistemi, görev yöntemlerini bellek parametrelerinde oluşturmanıza ve saklamanıza izin verir. "Örnek Laboratuvar Uygulaması" (GLP) kriterlerini karşılarlar ve Rusya Federasyonu Ölçüm Cihazları Sicilinde listelenirler. Ölçüm protokolleri İngiltere, ABD, Almanya ve Fransa Farmakopelerine uygun olarak yayınlanmaktadır.
TSP modüler sistemleri, operasyonda en yüksek güvenilirlik ve kararlılık ile karakterize edilir.
Modüllerin kombinasyonu, analiste bir yandan entegre bir sistemin tüm avantajlarını ve diğer yandan modüler bir sistemin esnekliğini sağlar. Farmakoloji, biyoteknoloji, çevre analizi, klinik analiz, yiyecek ve içecek analizi, petrokimya ve kimyasal analiz - Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisinin (HPLC) hangi uygulama alanı kullanılırsa kullanılsın, bu cihaz her zaman en yüksek gereksinimleri karşılamak için en uygun şekilde yapılandırılır. .
Hem araştırma hem de yüksek performanslı rutin sistemler şunları sağlar:
Yüksek verimli solvent gaz giderme
Küçük ve ultra küçük numune miktarlarıyla çalışabilme
Hem UV/VIS dedektörü hem de diyot dizisi ile en yüksek hassasiyet (1 veya 5 cm optik yol uzunluğu seçeneği ile ünlü LightPipe teknolojisi ile)
Farklı sütunlarla çalışma
En Yüksek Kantitatif Doğruluk
Farklı numune hacimleri ile otomatik çalışma imkanı
RMS tutma süresi hatası %0,3'ten az
Asgari çalışma alanı sistem tarafından işgal
En yüksek güvenilirlik ve parametre kararlılığı.
Sörveyör LC Pompası- Dünyada mevcut herhangi bir 4 bileşenli gradyan pompasının en iyi tutma süresi tekrarlanabilirliğine sahip bir HPLC pompası. Entegre bir dört kanallı vakumlu gaz giderici ve darbe sönümleyici, maksimum kantitasyon hassasiyeti ve doğruluğu için mükemmel temel stabilite sağlar.
Otomatik örnekleyici, en yüksek performansı ve analiz esnekliğini sağlar. Standart şişelerden 96 ve 384 kuyulu mikroplakalara kadar geniş bir numune tepsisi yelpazesi, neredeyse tüm uygulamaların ihtiyaçlarını karşılar. Yeni teknoloji neredeyse hiç numune enjeksiyonu kaybı sağlamaz, toplam 5 µl numune hacminden yaklaşık 5 µl numune bir otomatik numune alıcı ile enjekte edilir.
ANKETÖR
UV/Görsel Dedektör ve PDA (Diyot Dizisi Dedektörü)
Sörveyör UV/Vis- değişken dalga boyu ultraviyole ve görünür ışık dedektörü, LightPipe teknolojisinin en yüksek hassasiyeti ile ekonomi ve güvenilirliğin bir birleşimidir. Geniş akış hücresi seçimi, bu dedektörü kapiler veya mikrokolon kromatografisi kullananlardan yarı hazırlayıcı ve hazırlayıcıya kadar tüm uygulamalar için çok yönlü hale getirir.
Sörveyör PDA'sı Dedektör, tüm HPLC diyot dizisi dedektörleri arasında en hassas olanıdır. Çift lambalı kaynak optikleri, 190 ila 800 nm arasındaki tüm dalga boyu aralığını sorunsuz bir şekilde kapsar. Fiber optik huzme oluşturucu, hassasiyetten ödün vermeden mükemmel optik çözünürlük sağlar.
sörveyör RI bir bilgisayardan tam elektronik kontrollü, minimum hacimli termostatlı küvete sahip refraktometrik dedektör.
sörveyör FL floresan, kemilüminesans ve fosforesans için en yüksek hassasiyet ve algılama kapasitesine sahip florometrik tarama dedektörü.
Çok çeşitli otomatik numune alıcılar, biyokimyada ve klinik uygulamada yaygın olarak kullanılan hem geleneksel şişelerle hem de 96 konumlu plakalarla çalışmanıza olanak tanır. İşlem, benzer SPE numune hazırlama plakalarının kullanımıyla kolaylaştırılmıştır.
400 Elektrikli tahrik, Valco döngüsü (20 µl - standart), kısmi doldurma imkanı.
Carousel 96 örnekleri.
Elektrikli sürücü, kolon termostatı, Valco döngüsü (100 µl - standart), kısmi doldurma imkanı ile Numune hazırlama için AutoMix modu. Örnek karusel: 84 x 2 ml (numuneler) + 3 x 10 ml (reaktifler). Dahili kolon termostatı. 420
için döngü otomatik örnekleyici Araştırma çalışması tam, kısmi doldurma ve mikrolitre örneklerinin tanıtılması modlarında çalışma yeteneği ile. Geniş bir karusel yelpazesi (standart - 96 numune).
96 ve 384 konumlu plakalar için tablet otomatik örnekleyici. Numunenin basınç döngüsüne enjeksiyonu, 1 µl'den daha az numune verme olasılığı. Bir tablet besleyici kurma imkanı. HPLC
HPLC ekipmanının başlıca üreticileri
· Waters - yüksek performanslı kromatografi, kütle spektrometrisi, kolonlar, katı faz ekstraksiyonu;
Varyan, Inc. - kromatograflar ve kolonlar, katı faz ekstraksiyonu için aksesuarlar;
· Agilent Technologies - kromatograflar ve kolonlar;
· Hypersil - kolonlar ve sorbentler.
· Merck KGaA - TLC için TLC plakaları ve aksesuarları, kolonlar, sorbentler HPLC için mobil fazlar, katı faz ekstraksiyonu için aksesuarlar
· Dionex - HPLC, özellikle iyon kromatografisi için ekipman ve kolonlar.
Edebiyat
1.Pilipenko A.T., Pyatnitsky I.V. Analitik Kimya. İki kitapta: kn..1 - M.: Kimya, 1990, -480s.
1. Pilipenko A.T., Pyatnitsky I.V. Analitik Kimya. İki kitapta: kn..2 - M.: Kimya, 1990, -480s.
2. Vasilyev V.P. Analitik Kimya. 2. Bölüm Fiziksel ve kimyasal analiz yöntemleri: Proc. Khimko için - technol. uzman. üniversiteler. - M.: Daha yüksek. okul, 1989. - 384s.
3. Hidrokimyasal malzemeler. Cilt 100. Yüzey suyu kalitesinin operasyonel izlenmesi için yöntemler ve teknik araçlar. L.: Gidrometeo-izdat, 1991. - 200s.
4. Lurie Yu.Yu. Endüstriyel atık suların analitik kimyası / Yu.Yu. Lurie; M.: Kimya Yu, 1984. - 448'ler.
5. Ewing G. Enstrümantal kimyasal analiz yöntemleri / Per. İngilizceden. M.: Mir, 1989. - 348 s.
6. Görelik D.O., Konopelko L.A., Pankov E.D. Çevresel izleme. 2 ciltte St. Petersburg: Noel. 2000. - 260 s.
7. Ayvazov B.V. Kromatografiye giriş. M.: Daha yüksek. okul, 1983. - 450 s.
8. Goldberg K.A., Vigdergauz M.S. Gaz kromatografisine giriş. M.: Kimya, 1990. - 329 s.
9. Stolyarov B.V. ve diğerleri // Pratik gaz ve sıvı kromatografisi. St. Petersburg: St. Petersburg Devlet Üniversitesi, 1998. - S. 81.
11. Gorshkov A.G., Marinaite I.I. HPLC - çevresel nesnelerdeki PAH'ları izlemek için bir yöntem
12. Torosyan G.O., Martirosyan V.A., Aleksanyan A.R., Zakaryan M.O. Hadde bakır ölçeğinin aluminotermal indirgenmesinin atık ürünleri kullanılarak anilinin sulu çözeltilerden çıkarılması
13. Los Angeles Turkina, G.N. Koroleva İyon yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile toprak alkali elementlerin ve magnezyumun tayini için bir yöntemin geliştirilmesi
14. Dultseva G.G., Dubtsova Yu.Yu., Skubnevskaya G.I. Çevredeki kadmiyum komplekslerinin analizi
Başvuru
KROMATOGRAFİK YÖNTEMLERLE SUDA KLOMAZONE TAYİNİ
METODOLOJİK TALİMATLAR MUK 4.1.1415-03
1. Hazırlayan: Federal Hijyen Bilim Merkezi. F.F.
Erisman; Moskova Tarım Akademisi. K.A.
Timiryazev; Rusya Sağlık Bakanlığı Devlet Sıhhi ve Epidemiyolojik Gözetim Dairesi'nin katılımıyla. Metodolojinin geliştiricileri sonunda listelenmiştir.
3. Devlet Sağlık Başhekimi tarafından onaylanmıştır
Rusya Federasyonu, Rusya Federasyonu Sağlık Birinci Bakan Yardımcısı, acad. RAMS G.G. Onishchenko 24 Haziran 2003
5. İlk kez tanıtıldı.
1. Giriş
Üretici: FMS (ABD).
Ticari isim: KOMUT.
Aktif madde: klomazon.
2-(2-klorobenzil)-4,4-dimetil-3-izoksalidin-3-on (IUPAC)
Açık kahverengi viskoz sıvı.
Erime noktası: 25 -C.
Kaynama noktası: 275 -C.
25 -C'de buhar basıncı: 19,2 MPa.
Bölme katsayısı n-oktanol/su: K logP = 2.5.
Aseton, heksan, etanol, metanolde yüksek oranda çözünür,
kloroform, diklorometan ve asetonitril; sudaki çözünürlük -
1.10 g/m³. dm. Oda sıcaklığında en az 2 yıl, 50 -C'de - en az 3 ay stabildir.
Kısa toksikolojik profil: Akut oral
sıçanlar için toksisite (LD) - 1369 - 2077 mg/kg; akut dermal
sıçanlar için toksisite (LD) - 2000 mg/kg'dan fazla; akut
sıçanlar için inhalasyon toksisitesi (LC) - 4.8 mg / cu. dm (4 saat).
Hijyenik standartlar. Suda MPC - 0.02 mg / cu. dm.
İlacın kapsamı. Clomazone, soya fasulyesi ve pirinç ekinlerinde çıkış öncesi veya ekim öncesi uygulama sırasında tahılları ve iki çenekli yabani otları kontrol etmek için kullanılan seçici bir herbisittir.
2. Suda klomazon belirleme yöntemi
kromatografik yöntemler
2.1. Anahtar noktaları
2.1.1. Tekniğin prensibi
Teknik, analiz edilen numuneden heksan ile klomazon ekstraksiyonuna, ekstraktın konsantrasyonuna ve ardından alternatif yöntemlerle kantitatif belirlemeye dayanır:
ile yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC)
ultraviyole dedektörü, sabit rekombinasyon hızı dedektörü veya ince tabaka kromatografisi (TLC) ile gaz sıvı kromatografisi (GLC). Kantitatif belirleme, mutlak kalibrasyon yöntemiyle gerçekleştirilir.
2.1.2. Yöntem seçiciliği
Önerilen koşullar altında, yöntem, küresel çevresel kirleticilerin varlığında spesifiktir: sikloparafinlerin klor türevleri (HCH izomerleri), difenil bileşikleri (DDT ve türevleri), bunların metabolitleri - poliklorlu benzenler ve fenoller ve ayrıca mevcudiyetinde. Ekinlerde herbisit olarak kullanılabilen sodyum trikloroasetat.
2.1.3. Yöntemin metrolojik özelliği (P = 0.95)
Reaktifler, solüsyonlar ve malzemeler
d içeriği ile Clomazone. %99.8
(FMS, ABD)
Azot, ya da GOST 9293-79
Su amonyak, %25, h GOST 1277-81
Aseton, h GOST 2603-79
n-Heksan, h GOST 2603-79
Hidrojen peroksit, %30 sulu çözelti GOST 10929-77
İzopropil alkol, kimyasal olarak saf TU 6-09-402-75
Sülfürik asit, kimyasal olarak saf GOST 4203-77
Hidroklorik asit (hidroklorik), kimyasal olarak saf GOST 3118-77
Metil alkol, kimyasal olarak saf GOST
Sodyum hidroksit, kimyasal olarak saf, %25 sulu çözelti GOST 4323-77
Sodyum sülfat susuz, kimyasal olarak saf GOST 1277-81
Gümüş nitrat, kimyasal olarak saf GOST 1277-81
2-Fenoksimetanol, h TU 6-09-3688-76
Kromaton N-AW-DMCS (0,16 - 0,20 mm)
%5 SE-30, Hemapol, Çek Cumhuriyeti
1.5 ile Kromaton N-AW-DMCS (0,16 - 0,20 mm)
OV-17 + %1.95 QF-1, Hemapol, Çek Cumhuriyeti
HPTLC (SSCB) için Plakalar
"Kieselgel 60 F-254" kayıtları (Almanya)
Kayıtlar "Silufol" Çek Cumhuriyeti
Kağıt filtreler "beyaz bant", külsüz ve hekzan ile önceden yıkanmış TU 6-09-2678-77
2.3. Çatal bıçak takımı, ekipman, mutfak eşyaları
Sıvı kromatografı Milikrom
UV dedektörü ile
Kromatografik çelik kolon,
uzunluk 64 mm, iç çap 2 mm,
Silasorb 600 ile doldurulmuş, tane boyutu 5 µm
Gaz kromatograf serisi "Renkli" veya
benzer, sabit bir dedektörle donatılmış
limitli rekombinasyon oranı (RPR)
lindan 4 x 10 g/cu ile algılama. santimetre
Kromatografik cam kolon, uzunluk
1 veya 2 m, iç çap 2 - 3 mm
Mikroşırınga tipi MSH-10, kapasite 10 µl TU 5E2-833-024
AVU-6s TU 64-1-2851-78 tipi sallama aparatı
Su banyosu TU 64-1-2850-76
Analitik terazi tipi VLA-200 GOST 34104-80E
Kromatografik oda GOST 10565-74
Su jeti pompası GOST 10696-75
Cıva-kuvars radyatör tipi OKN-11 TU 64-1-1618-77
Püskürtme tabancaları cam GOST 10391-74
Döner vakumlu evaporatör IR-1M
veya benzeri TU 25-11-917-76
Kompresör ünitesi TU 64-1-2985-78
Kurutma dolabı TU 64-1-1411-76E
Bölme hunileri GOST 3613-75
100 ml kapasiteli hacimsel şişeler GOST 1770-74
10, 50 ml kapasiteli ölçüm silindirleri GOST 1770-74E
İnce kesitli armut biçimli şişeler,
100 ml kapasiteli GOST 10394-72
100 ml kapasiteli konik şişeler GOST 22524-77
Santrifüj test tüpleri, ölçülen GOST 25336-82E
0.1, 1, 2, 5 ve 10 ml kapasiteli pipetler GOST 20292-74
Kimyasal huniler, konik, çap
34 - 40 mm GOST 25336-82E
2.4. Örnek seçimi
Numune alma, saklama ve numunelerin hazırlanması, ilgili mevzuata uygun olarak gerçekleştirilir.
21.08.79 tarihli N 2051-79 için onaylanan "Eser miktarlarının belirlenmesi için tarım ürünleri, gıda ürünleri ve çevresel nesnelerden numune alınması için birleşik kurallar"
Alınan numuneler buzdolabında 5 güne kadar saklanabilir. Analizden önce su (süspansiyon varlığında) gevşek bir kağıt filtreden süzülür.
2.5. Tanım için hazırlık
2.5.1. HPLC Yöntemi
2.5.1.1. HPLC için mobil faz hazırlığı
100 ml kapasiteli bir ölçülü balona 5 ml izopopanol ve 5 ml metanol bir pipetle yerleştirilir, işarete kadar hekzan ile doldurulur, karıştırılır, süzülür.
2.5.1.2. sütun koşullandırma
HPLC kolonunu 30 dakika boyunca heksan-metanol-izopropanol (90:5:5, v/v) ile durulayın. 100 µl/dk'lık bir solvent besleme hızında.
2.5.2. GLC yöntemi. Kolon hazırlama ve şartlandırma
Bitmiş ambalaj (Chromaton N-AW-DMCS üzerinde %5 SE-30) bir cam kolona dökülür, vakum altında sıkıştırılır, kolon kromatograf termostatına takılır, dedektöre bağlı değildir ve bir nitrojen akışında stabilize edilir 10 - 12 öğlen 250 -C sıcaklıkta
2.5.3. TLC yöntemi
2.5.3.1. Geliştirme reaktiflerinin hazırlanması
2.5.3.1.1. 1 numaralı reaktifin geliştirilmesi
1 gr gümüş nitrat 1 ml distile suda çözülür, 10 ml 2-fenoksimetanol, 190 ml aseton, 1-2 damla hidrojen peroksit ilave edilir, çözelti karıştırılır ve koyu renkli bir cam şişeye aktarılır.
2.5.3.2.2. Reaktif N 2 geliştirme
0,5 g gümüş nitrat 5 ml distile suda 100 ml'lik ölçülü balonda çözülür, 10 ml %25 sulu amonyak eklenir, çözelti aseton ile 100 ml'ye ayarlanır, karıştırılır ve koyu renkli cam bir şişeye aktarılır.
2.5.3.2. TLC için mobil faz hazırlığı
100 ml kapasiteli bir ölçülü balona 20 ml aseton ekleyin ve işarete kadar heksan ekleyin, karıştırın. Karışım, 30 dakikada 6 - 8 mm'den fazla olmayan bir tabaka ile kromatografik hazneye dökülür. Kromatografiye başlamadan önce.
2.5.4. Standart çözeltilerin hazırlanması
100 ug/mL'lik bir klomazon stok standart solüsyonu, 100 mL'lik bir ölçülü balon içinde heksan içinde %99.8 AI içeren bir preparasyonun 0.010 g'ı çözülerek hazırlanır. Çözelti bir ay boyunca buzdolabında saklanır.
0,4 konsantrasyonlu çalışma standart çözümleri; 1.0; 2.0; 4.0; 10.0; 20 ve 40.0 ug/ml, heksan ile uygun seri seyreltmelerle klomazon stok standart solüsyonundan hazırlanır.
Çalışma çözümleri buzdolabında bir aydan fazla saklanmaz.
2.5.5. Kalibrasyon grafiğinin oluşturulması
2.5.5.1. Kalibrasyon eğrisi A (paragraf 2.7.1, HPLC'ye göre ölçüm)
Bir kalibrasyon grafiği oluşturmak için, kromatograf enjektörüne 4.0 konsantrasyonlu 5 µl çalışan standart klomazon çözeltisi enjekte edilir; 10.0; 20.0 ve 40 ug/ml.
2.5.5.2. Kalibrasyon eğrisi B (paragraf 2.7.2, GLC'ye göre ölçüm)
Bir kalibrasyon grafiği oluşturmak için, kromatograf buharlaştırıcısına 0,4 konsantrasyonlu 5 µl çalışan standart klomazon çözeltisi enjekte edilir; 1.0; 2.0; 4.0 ve 10.0.
En az 5 paralel ölçüm yapın. Her konsantrasyon için kromatografik zirvenin ortalama yüksekliğini bulun. Kromatografik pikin yüksekliğinin mm cinsinden çözeltideki klomazon konsantrasyonuna µg/ml cinsinden bağımlılığını gösteren bir kalibrasyon grafiği (A veya B) oluşturun.
2.6. Tanım Açıklama
100 ml analiz edilen su numunesi 250 ml kapasiteli bir ayırma hunisine konur, 10 ml %25'lik sulu sodyum hidroksit çözeltisi eklenir, karıştırılır ve 20 ml n-heksan eklenir. Huni 3 dakika çalkalanır, faz ayrımından sonra hekzan tabakası, pileli bir filtre kağıdı üzerinde konik bir huni içine yerleştirilmiş bir susuz sodyum sülfat tabakasından geçirilerek 100 ml kapasiteli armut biçimli bir şişeye dökülür. İlacın sulu numuneden ekstraksiyonu, 20 ml n-heksan kullanılarak iki kez daha tekrarlanır. Birleştirilen heksan özü, 40°C'lik bir sıcaklıkta, neredeyse kuruyana kadar bir döner vakumlu buharlaştırıcıda buharlaştırılır, tortu, bir hava akımı veya özel saflıkta nitrojen ile üflenir. Kuru kalıntı 0.1 (HPLC, TLC) veya 0.25 ml (GLC) n-heksan içinde çözülür ve kromatografik yöntemlerden biri ile analiz edilir.
2.7. kromatografi koşulları
Ultraviyole dedektörlü sıvı kromatografı Milichrom (Rusya).
64 mm uzunluğunda çelik kolon, 2 mm iç çap,
tane boyutu 5 mikron olan Silasorb 600 ile doldurulmuştur.
Sütun sıcaklığı: oda.
Mobil faz: heksan-izopropanol-metanol (90:5:5, v/v).
Eluent akış hızı: 100 µl/dk.
Çalışma dalga boyu: 240 nm.
Hassasiyet: 0,4 birim ölçekte emilim.
Enjeksiyon hacmi: 5 µl.
Clomazone çıkış süresi: yaklaşık 6 dk.
Doğrusal algılama aralığı: 20 - 200 ng.
40 µg/mL standart solüsyondan daha büyük pikler üreten numuneler, HPLC mobil faz ile seyreltilir.
Sabit iyon rekombinasyon hızı dedektörlü gaz kromatografı "Tsvet-570".
1 m uzunluğunda, 3 mm iç çaplı, %5 SE-30 (0,16 - 0,20 mm) ile Chromaton N-AW-DMCS ile doldurulmuş cam kolon.
Elektrometrenin çalışma ölçeği 64 x 10 10 Ohm'dur.
Kaydedici bant hızı 200 mm/saat.
Kolon termostat sıcaklığı - 190 -C
dedektör - 300 -C
evaporatör - 220 -C
Taşıyıcı gazın (azot) hızı - 60 ml / dak.
Enjekte edilen numunenin hacmi 5 µl'dir.
Klomazonun çıkış süresi 2,5 dakikadır.
Doğrusal algılama aralığı: 2 - 50 ng.
10 µg/mL standart solüsyondan daha büyük pikler üreten numuneler heksan ile seyreltilir.
Numunede yakın bir alıkonma süresine sahip gama-HCCH varlığında klomazon tanımlamasının doğruluğunu arttırmak için, klomazon konsantre sülfürik asit ile muamele edilerek numuneden çıkarılır. Numunenin yeniden analizi, klomazonun birincil kromatografik sinyale katkısını belirlemenizi sağlar.
Paragraf 2.6'ya göre nicel olarak elde edilen bir şişede heksan çözeltisi
(veya bunun bir alikotu) "Silufol", "Kieselgel 60F-254" veya "HPTLC Plakaları" kromatografik plakalarına uygulanır. Yakınlarda, klomazon 1, 2, 5 ve 10 μg içeriğine karşılık gelen bir hacimde standart çözeltiler uygulanır. Plaka, bir n-heksan-aseton (4:1, v/v) karışımı içeren bir kromatografik odaya yerleştirilir. Kromatogramın geliştirilmesinden sonra, plaka hazneden çıkarılır, çözücüler buharlaşana kadar taslak altına yerleştirilir, ardından geliştirici reaktiflerden biri ile işlenir ve 5 dakika boyunca bir ultraviyole lambasının altına yerleştirilir. İlacın "Silufol", "HPTLC için plakalar" ve "Kieselgel 60F-254" plakaları üzerindeki lokalizasyon bölgesi, sırasıyla 0.35, 0.85 ve 0.43 Rf değerine sahip gri-kahverengi noktalar olarak görünür. TLC ile klomazonu belirlemek için "Alugram" ve "Polygram" (Almanya tarafından üretilmiştir) plakalarını kullanabilirsiniz. Bu plakalardaki klomazonun Rf değeri sırasıyla 0.37 ve 0.38'dir.
3. Güvenlik gereksinimleri
Organik çözücüler, toksik maddeler, elektrikli ısıtıcılar ile çalışırken genel kabul görmüş güvenlik kurallarına uymak gerekir.
4. Ölçüm hatası kontrolü
Hatanın operasyonel kontrolü ve ölçümlerin tekrarlanabilirliği, MI 2335-95 tavsiyelerine göre gerçekleştirilir. GSI "Kantitatif kimyasal analiz sonuçlarının iç kalite kontrolü".
5. Geliştiriciler
Yudina T.V., Fedorova N.E. (FNTSG, adını F.F. Erisman'dan almıştır).
Davidyuk E.I. (UkrNIIGINTOX, Kiev); Kisenko M.A., Demchenko V.F. (Bilimler Akademisi Mesleki Tıp Enstitüsü ve Ukrayna Tıp Bilimleri Akademisi, Kiev).
Bir kolon üzerinde sıvı adsorpsiyon kromatografisi
Bir adsorpsiyon kolonunda bir madde karışımının ayrılması, belirli bir adsorban üzerindeki emilebilirliklerindeki farklılıkların bir sonucu olarak meydana gelir (M.S. Tsvet tarafından kurulan adsorpsiyon ikame yasasına göre).
Adsorbanlar, moleküller arası ve yüzey fenomenlerinin yardımıyla sıvıları tutan oldukça gelişmiş bir iç yüzeye sahip gözenekli cisimlerdir. Bunlar polar ve polar olmayan inorganik ve organik bileşikler olabilir. Polar adsorbanlar arasında silika jel (kurutulmuş jelatinli silikon dioksit), alüminyum oksit, kalsiyum karbonat, selüloz, nişasta vb. bulunur. Polar olmayan emiciler - aktif karbon, kauçuk tozu ve sentetik olarak elde edilen diğerleri.
Adsorbanlar aşağıdaki gerekliliklere tabidir: S hareketli faz ve ayrılacak maddelerle kimyasal reaksiyonlara girmemelidir; S mekanik dayanıma sahip olmalıdır; Adsorbanın S taneleri aynı derecede dağılma olmalıdır.
Kromatografik işlem için koşullar seçilirken, adsorban ve adsorbe edilen maddelerin özellikleri dikkate alınır.
Sıvı kolon kromatografisinin (LCC) klasik versiyonunda, bir sorbent (NP) ile doldurulmuş 0,5-5 cm çapında ve 20-100 cm uzunluğunda bir cam tüp olan kromatografik bir kolondan bir eluent (PF) geçirilir. Eluent yerçekimi etkisi altında hareket eder. Hareketinin hızı, kolonun altındaki vinç tarafından ayarlanabilir. Analiz edilecek karışım kolonun en üstüne yerleştirilir. Numune kolon boyunca hareket ettikçe bileşenler ayrılır. Belirli aralıklarla, analit konsantrasyonlarının ölçülmesine izin veren herhangi bir yöntemle analiz edilen kolondan salınan eluent fraksiyonları alınır.
Sütun adsorpsiyon kromatografisi şu anda esas olarak bağımsız bir analiz yöntemi olarak değil, karmaşık karışımların daha basit olanlara, yani. diğer yöntemlerle (kromatografik dahil) analize hazırlanmak için. Örneğin, bir alümina kolonu üzerinde bir tokoferol karışımı ayrılır, eluent geçirilir ve sonraki fotometrik belirleme için a-tokoferol fraksiyonu toplanır.
PF'nin yavaş ilerlemesi nedeniyle kolondaki karışımın kromatografik olarak ayrılması uzun zaman alır. İşlemi hızlandırmak için kromatografi basınç altında gerçekleştirilir. Bu yönteme Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) denir.
Klasik sıvı kolon kromatografisinde kullanılan ekipmanın modernizasyonu, onu en umut verici ve en umut verici olanlardan biri haline getirdi. modern yöntemler analiz. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi, hem düşük hem de yüksek moleküler ağırlıklı uçucu olmayan, ısıya dayanıklı bileşiklerin ayrılması, hazırlayıcı izolasyonu ve kalitatif ve kantitatif analizi için uygun bir yöntemdir.
Kullanılan sorbent tipine bağlı olarak, bu yöntem 2 kromatografi seçeneği kullanır: polar olmayan bir eluent kullanan bir polar sorbent üzerinde (doğrudan faz seçeneği) ve polar bir eluent kullanan polar olmayan bir sorbent üzerinde - ters fazlı yüksek olarak adlandırılır -performans sıvı kromatografisi (RP HPLC).
Eluent, eluent'e geçtiğinde, RPHLC koşulları altındaki denge, polar sorbentler ve susuz PF'lerin koşullarına göre birçok kez daha hızlı kurulur. Bunun bir sonucu olarak, su ve su-alkollü eluentlerle çalışma kolaylığının yanı sıra RPHLC artık büyük popülerlik kazanmıştır. Çoğu HPLC analizi bu yöntem kullanılarak gerçekleştirilir.
HPLC için Enstrümantasyon
HPLC için bir dizi modern ekipman, kural olarak, bir mikroişlemci 5 tarafından kontrol edilen ve belirli bir programa göre eluent sağlayan iki pompadan 3,4 (Şekil 7.1.1.1) oluşur. Pompalar 40 MPa'ya kadar basınç oluşturur. Numune, özel bir cihaz (enjektör) 7 aracılığıyla doğrudan eluent akışına enjekte edilir. Kromatografik sütun 8'den geçtikten sonra maddeler, sinyali mikrobilgisayar 11 tarafından kaydedilen ve işlenen oldukça hassas bir akış detektörü 9 tarafından algılanır. Gerekirse, fraksiyonlar tepe çıkışı anında otomatik olarak seçilir.
HPLC için kolonlar, iç çapı 2 - 6 mm ve uzunluğu 10-25 cm olan paslanmaz çelikten yapılmıştır Kolonlar bir sorbent (NF) ile doldurulur. NF olarak silika jel, alümina veya modifiye edilmiş emiciler kullanılır. Silika jel genellikle yüzeyine çeşitli fonksiyonel grupların kimyasal olarak eklenmesiyle modifiye edilir.
Dedektörler. Ayrı bir bileşenin sütunundan çıktının kaydı, bir dedektör kullanılarak gerçekleştirilir. Kayıt için, mobil fazdan gelen ve karışım bileşeninin niteliği ve miktarı ile ilgili herhangi bir analitik sinyaldeki değişikliği kullanabilirsiniz. Sıvı kromatografisi, mevcut çözeltinin ışık absorpsiyonu veya ışık emisyonu (fotometrik ve florimetrik dedektörler), kırılma indisi (refraktometrik dedektörler), potansiyel ve elektriksel iletkenlik (elektrokimyasal dedektörler) vb. gibi analitik sinyalleri kullanır.
Sürekli olarak algılanan sinyal, kaydedici tarafından kaydedilir. Kromatogram, bir karışımın tek tek bileşenleri kolondan ayrıldığında üretilen, bir teyp üzerinde kaydedilen dedektör sinyalleri dizisidir. Karışımın ayrılması durumunda, harici kromatogramda ayrı pikler görülebilir. Kromatogram üzerindeki pikin konumu, maddenin tanımlanması amacıyla, pikin yüksekliği veya alanı kantitatif belirleme amacıyla kullanılır.
Kalitatif Analiz
Kromatogramın en önemli özellikleri - alıkonma süresi tR ve bununla ilişkili alıkonma hacmi - maddelerin doğasını, sabit fazın materyali üzerinde soğurma yeteneklerini yansıtır ve bu nedenle, sabit kromatografi koşulları altında, bunlar bir maddeyi tanımlama yöntemidir. Belirli bir akış hızı ve sıcaklığa sahip belirli bir sütun için, her bir bileşiğin alıkonma süresi sabittir (Şekil 7.1.1.2), burada t.R(A), enjekte edildiği andan itibaren analiz edilen karışımın A bileşeninin alıkonma süresidir. sütun çıkışında maksimum tepe görünene kadar sütun, 1K( ss) - iç standardın tutma süresi (analiz edilen karışımda başlangıçta bulunmayan madde), h - tepe yüksekliği (mm), ab - yüksekliğinin yarısında tepe genişliği, mm.
Bir maddeyi kromatogram ile tanımlamak için genellikle standart numuneler veya saf maddeler kullanılır. Bilinmeyen IR* bileşeninin alıkonma süresini, bilinen maddelerin IRCT alıkonma süresiyle karşılaştırın. Ancak göreceli alıkoyma süresini ölçerek daha güvenilir tanımlama
Bu durumda, bilinen bir madde (dahili standart) önce kolona eklenir ve alıkonma süresi tR(Bc) ölçülür, ardından test karışımı kromatografik olarak ayrılır (kromatografiye tabi tutulur), buna ön olarak iç standart eklenir. Göreceli alıkonma süresi formül (7.1.1.1) ile belirlenir.
Kantitatif Analiz
Bu analiz, h tepe yüksekliğinin veya S alanının madde miktarına bağımlılığına dayanmaktadır. Dar tepeler için, geniş bulanık tepeler - S için h ölçümü tercih edilir. Pik alanı farklı şekillerde ölçülür: tepe yüksekliği (h) genişliğiyle (ai / 2) çarpılarak, yüksekliğinin yarısında ölçülür (Şek. 7.2.3); planlama; bir entegratör kullanarak. Modern kromatograflar, elektrikli veya elektronik entegratörlerle donatılmıştır.
Bir numunedeki maddelerin içeriğini belirlemek için başlıca üç yöntem kullanılır: mutlak kalibrasyon yöntemi, dahili normalizasyon yöntemi ve dahili standart yöntemi.
Mutlak kalibrasyon yöntemi, eklenen maddenin miktarı ile kromatogramdaki tepe noktasının alanı veya yüksekliği arasındaki ilişkinin önceden belirlenmesine dayanır. Kalibrasyon karışımının bilinen bir miktarı kromatograma eklenir ve elde edilen piklerin alanları veya yükseklikleri belirlenir. Enjekte edilen madde miktarından tepe noktasının alanı veya yüksekliğinin bir grafiğini oluşturun. Test numunesi analiz edilir, belirlenecek bileşenin tepe noktasının alanı veya yüksekliği ölçülür ve kalibrasyon eğrisine göre miktarı hesaplanır.
Bu yöntem, karışımdaki bileşenin yalnızca nispi içeriği hakkında bilgi sağlar, ancak mutlak değerinin belirlenmesine izin vermez.
Dahili standart yöntemi, bir analitin seçilen bir tepe parametresinin, numuneye bilinen bir miktarda verilen standart bir maddenin aynı parametresiyle karşılaştırılmasına dayanır. Bu tür bir standart maddenin bilinen bir miktarı, tepe noktası test karışımının bileşenlerinin tepe noktalarından yeterince iyi ayrılmış olan test numunesine verilir.
Son iki yöntem, kullanılan dedektörlerin analiz edilen maddelere duyarlılığını karakterize eden düzeltme faktörlerinin kullanılmasını gerektirir. Farklı dedektör türleri ve farklı maddeler için duyarlılık katsayısı deneysel olarak belirlenir.
Sıvı adsorpsiyon kromatografisi ayrıca maddenin kolondan çıktığı anda toplanan çözeltilerin fraksiyonlarının analizini de kullanır. Analiz çeşitli fizikokimyasal yöntemlerle gerçekleştirilebilir.
Sıvı adsorpsiyon kromatografisi öncelikle organik maddelerin ayrılması için kullanılır. Bu yöntem, yağın, hidrokarbonların bileşimini incelemede, trans- ve cis-izomerleri, alkaloidleri vb. etkili bir şekilde ayırmada çok başarılıdır. HPLC, boyaları, organik asitleri, amino asitleri, şekerleri, pestisit ve herbisit safsızlıklarını, tıbbi maddeleri belirlemek için kullanılabilir. ve gıda ürünlerindeki diğer kirleticiler.
(OFS 42-0096-09)
Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC), mobil fazın (MP) sıvı olduğu bir kolon kromatografi yöntemidir.
desteklenmeyen maddelerle dolu kromatografik bir kolonda hareket eden kemik
görsel faz (sorbent). HPLC kolonları, kolon girişindeki yüksek hidrolik basınç ile karakterize edilir, bu nedenle bazen HPLC olarak adlandırılır.
"Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi" olarak adlandırılır.
Maddelerin ayrılma mekanizmasına bağlı olarak, aşağıdakiler ayırt edilir:
genel HPLC seçenekleri: adsorpsiyon, dağıtım, iyon değişimi,
özel, kiral, vb.
Adsorpsiyon kromatografisinde, maddelerin ayrılması, artan adsorpsiyon ve desorpsiyon yetenekleri nedeniyle meydana gelir.
gelişmiş bir yüzeye sahip adsorbanın yüzeyi, örneğin silika jel.
Bölme HPLC'de, ayrıştırılacak maddelerin hareketsiz maddeler arasındaki dağılım katsayılarının farklı olması nedeniyle ayrılma meydana gelir.
(genellikle sabit bir taşıyıcının yüzeyine kimyasal olarak aşılanır) ve
mobil aşamalar.
Polariteye göre, PF ve NF HPLC, normal faz ve ob-
faz dönüşü.
Normal faz, kromatografinin bir varyantı olarak adlandırılır.
polar bir sorbent kullanın (örneğin, silika jel veya eklenmiş silika jel
bükülmüş NH2 - veya CN grupları) ve polar olmayan PF (örneğin, farklı
kişisel takviyeler). Kromatografinin ters fazlı varyantında,
polar olmayan kimyasal olarak değiştirilmiş emici maddeler kullanın (örneğin,
polar olmayan alkil radikali C18) ve polar mobil fazlar (örneğin,
metanol, asetonitril).
İyon değişim kromatografisinde, karışımdaki maddelerin molekülleri, ayrışma
çözeltide katyonlara ve anyonlara, hareket ederken ayrılır
iyonik ile farklı döviz kurları nedeniyle sorbent (katyon değiştirici veya anyon değiştirici)
Sorbentin mi grupları.
Dışlamada (elek, jel nüfuz eden, jel-filtreleme)
Maddelerin kromatografi molekülleri, durağan fazın gözeneklerine farklı nüfuz etme yeteneklerinden dolayı boyutlarına göre ayrılır. Aynı zamanda, ilk
durağan fazın minimum sayıdaki gözeneklerine nüfuz edebilen en büyük moleküller (en yüksek moleküler ağırlıklı) kolonlardan çıkar,
ve moleküler boyutu küçük olan maddeler en son çıkar.
Çoğu zaman ayırma bir değil, aynı anda birkaç mekanizma ile gerçekleşir.
HPLC yöntemi, herhangi bir olumsuzluğun kalitesini kontrol etmek için kullanılabilir.
benzer analitler. Analiz için uygun aletler kullanılır - sıvı kromatograflar.
Bir sıvı kromatografın bileşimi genellikle aşağıdaki temel bileşenleri içerir:
düğümler:
– Mobil fazlı bir kap (veya bir kap) dahil olmak üzere PF hazırlama ünitesi
mobil fazın bir parçası olan bireysel çözücülerle sti
zy) ve PF gaz giderme sistemi;
– pompalama sistemi;
– mobil fazlı karıştırıcı (gerekirse);
– numune enjeksiyon sistemi (enjektör);
– kromatografik kolon (bir termostata monte edilebilir);
– dedektör;
– veri toplama ve işleme sistemi.
pompalama sistemi
Pompalar belirli bir sabit hızda kolona PF sağlar. Mobil fazın bileşimi sabit veya değişken olabilir.
analiz sırasında. İlk durumda, sürece izokratik denir,
ve ikinci degradede. Bazen pompalama sisteminin önüne monte edilir
mobil fazı filtrelemek için 0,45 µm gözenek çapına sahip filtreler. Modern
Bir sıvı kromatografının değişken pompalama sistemi, bir bilgisayar tarafından kontrol edilen bir veya daha fazla pompadan oluşur. Bu,
gradyan elüsyonu ile belirli bir programa göre PF olmak. küçük
PF bileşenlerinin karıştırıcıda karıştırılması, hem düşük basınçta gerçekleşebilir
iyon (pompalardan önce) ve yüksek basınçta (pompalardan sonra). Karıştırıcı, PF hazırlama ve izokratik elüsyon için kullanılabilir,
bununla birlikte, ön hazırlık ile daha doğru bir bileşen oranı elde edilir.
izokratik bir süreç için PF bileşenlerinin karıştırılması. Analitik HPLC pompaları, 50 MPa'ya kadar bir kolon giriş basıncında 0,1 ila 10 ml/dak aralığında kolona sabit bir PF akış hızı sağlamayı mümkün kılar. Ancak bu değerin aşılmaması tavsiye edilir.
Şalo 20 MPa. Basınç titreşimleri özel sönümleme ile en aza indirilir
pompaların tasarımına dahil olan yüksük sistemleri. Çalışma parçaları-
pompalar, PF'nin bileşiminde agresif bileşenlerin kullanılmasına izin veren korozyona dayanıklı malzemelerden yapılmıştır.
Musluklar
Tasarım gereği, karıştırıcılar statik veya dinamik olabilir.
mikrofon.
Karıştırıcıda, tek bir mobil faz oluşur.
Gerekli karışım önceden hazırlanmadıysa, pompalar tarafından sağlanan özel çözücüler. Çözücülerin karıştırılması genellikle kendiliğinden gerçekleşir, ancak bazen zorla karıştırmalı sistemler kullanılır.
dikiş.
enjektörler
Enjektörler, numunelerin tanıtılması için evrensel olabilir
1 µl ila 2 ml veya sadece belirli bir hacimde numune enjeksiyonu için ayrı
ema. Her iki enjektör türü de otomatik olabilir ("otomatik enjektörler" veya "otomatik numune alıcılar"). Numuneye (çözeltiye) girmek için enjektör -
kromatografik sütundan hemen önce. Enjektörün tasarımı, PF akışının yönünü değiştirmeyi ve önceden bir numuneyi belirli bir hacimli bir döngüye (genellikle 10 ila 100 µl) sokmayı mümkün kılar.
Bu hacim, döngü etiketinde belirtilmiştir. Enjektörün tasarımı, döngünün değiştirilmesine izin verir. Analiz edilen çözümü av-olmayanlara tanıtmak
tomatik enjektör, önemli ölçüde hacme sahip manuel bir mikro şırınga kullanır
döngünün hacmini büyük ölçüde aşan. Enjekte edilen çözeltinin fazlalığı,
döngüde atılır ve tam ve her zaman aynı hacimde numune kolona enjekte edilir. Döngünün manuel olarak eksik doldurulması doğruluğu azaltır
dozlama doğruluğu ve tekrarlanabilirliği ve sonuç olarak doğruluğu düşürür
ve kromatografik analizin tekrarlanabilirliği.
kromatografi sütunu
Kromatografik kolonlar genellikle paslanmaz çelik, sorbent ile doldurulmuş ve kapatılmış cam veya plastik tüplerdir.
her iki tarafta 2–5 µm gözenek çapına sahip filtrelerle. Analitik uzunluğu
kolon, kromatografik ayırma mekanizmasına bağlı olarak, 5 ila 60 cm veya daha fazla aralığında olabilir (genellikle
10-25 cm), iç çap - 2 ila 10 mm (genellikle 4,6 mm). Mikrokolon kromunda iç çapı 2 mm'den küçük olan kolonlar kullanılır.
tografi. İç çaplara sahip kapiler kolonlar da kullanılmaktadır.
rom yaklaşık 0,3-0,7 mm. Hazırlayıcı kromatografi için sütunların iç çapı 50 mm veya daha fazladır.
Analitik kolondan önce kısa kablolar takılabilir.
çeşitli yardımcı işlevleri yerine getiren sütunlar (ön sütunlar)
(daha sık - analitik sütunun korunması). Tipik olarak, analiz şu anda gerçekleştirilir:
Bununla birlikte, ayırma verimliliğini artırmak ve oda sıcaklığında
analiz süresini kısaltan bir termostat kullanılabilir
kolonların tirovaniyesi 60 C'den yüksek olmayan sıcaklıklarda. yüksek sıcaklıklar sorbentin olası tahribatı ve PF'nin bileşiminde bir değişiklik.
Sabit faz (sorbent)
Yaygın olarak kullanılan sorbentler şunlardır:
1. Normal şartlarda silika jel, alümina, gözenekli grafit kullanılır.
küçük faz kromatografisi. Bu durumda tutma mekanizması
çay - genellikle adsorpsiyon;
2. Asidik veya bazik gruplara sahip reçineler veya polimerler. Kapsam - iyon değişim kromatografisi;
3. Gözenekli silika jel veya polimerler (boyut dışlama kromatografisi);
4. Kimyasal olarak değiştirilmiş sorbentler (aşılı doku içeren sorbentler)
zami), en sık silika jel bazında hazırlanır. Çoğu durumda tutma mekanizması, mobil cihazlar arasındaki dağıtımdır.
nuh ve durağan fazlar;
5. Kimyasal olarak değiştirilmiş kiral sorbentler, örneğin,
sulu selülozlar ve amilozlar, proteinler ve peptitler, siklodekstrinler,
enantiyomerleri ayırmak için kullanılır (kiral kromatografi)
Bağlı faz sorbentleri değişen derecelerde kimyasal maddelere sahip olabilir.
chesky modifikasyonu. Emici partiküller küresel olabilir veya küresel olmayabilir.
düzenli şekil ve çeşitli gözeneklilik.
En yaygın olarak kullanılan bağlı fazlar şunlardır:
– oktil grupları(sorbent oktilsilan veya C8);
– oktadesil grupları(sorbent oktadesilsilan
(ODS) veya C18);
– fenil grupları(sorbent fenilsilan);
– siyanopropil grupları(sorbent CN);
– aminopropil grupları(NH2 sorbenti);
– diol grupları (sorbent diol).
Çoğu zaman, analiz polar olmayan bağlı fazlar üzerinde gerçekleştirilir.
C18 sorbent kullanarak ters faz modu.
Bazı durumlarda normal kullanmak daha uygundur.
faz kromatografisi. Bu durumda, polar olmayan çözünenlerle kombinasyon halinde silika jel veya polar bağlı fazlar ("CN", "NH2", "diol") kullanılır.
Bağlanmış faz sorbentleri, üretici tarafından aksi belirtilmedikçe, 2,0 ila 8,0 pH değerlerinde kimyasal olarak stabildir.
Emici partiküller, küresel veya düzensiz bir şekle ve çeşitli gözenekliliğe sahip olabilir. Analitik HPLC'de sorbentin partikül boyutu genellikle 3-10 µm'dir, hazırlayıcı HPLC'de ise 50 µm veya daha fazladır.
Monolitik sorbentler de kullanılır.
Yüksek ayırma verimliliği, emici parçacıkların (mikroskopilerinin bir sonucu olan) yüksek yüzey alanı ile sağlanır.
gözeneklerin varlığı), ayrıca sorbent bileşiminin tekdüzeliği ve yoğun ve tek tip ambalajı.
dedektörler
Çeşitli algılama yöntemleri kullanılır. Genel durumda, kromatografik bir kolondan sonra içinde çözünmüş bileşenler bulunan PF
ki, özelliklerinden birinin veya diğerinin sürekli olarak ölçüldüğü dedektör hücresine düşer (spektrumun UV veya görünür bölgesinde absorpsiyon, floresan,
kırılma indisi, elektriksel iletkenlik, vb.). Ortaya çıkan kromatogram, bazı fiziksel faktörlerin bağımlılığının bir grafiğidir.
veya PF'nin zamanında fiziko-kimyasal parametresi.
En yaygın olanları spektrofotometriktir.
optikte bir değişikliği kaydeden dedektörler (diyot matrisi dahil)
ultraviyole yoğunluğu, görünür ve genellikle yakın kızılötesi
190 ila 800 veya 900 nm arasındaki spektrumun diğer bölgeleri. Bu durumda kromatogram
çay, PF'nin optik yoğunluğunun zamana bağımlılığıdır.
Geleneksel olarak kullanılan spektrofotometrik dedektör,
çalışma aralığındaki herhangi bir dalga boyunda algılamaya izin verir
alan. İletkenliğe izin veren çok dalgalı dedektörler de kullanılır.
Aynı anda birkaç dalga boyunda algılama gerçekleştirin.
Bir diyot dizi dedektörü yardımıyla, sadece birkaç dalga boyunda bir kerede algılama yapmak değil, aynı zamanda neredeyse anında algılamak da mümkündür.
PF'nin optik spektrumunu herhangi bir zamanda elde etmek (taramadan) mümkündür, bu da ayrılan bileşenlerin kalitatif analizini büyük ölçüde basitleştirir
bileşenler.
Floresan dedektörlerin hassasiyeti, spektrofotometrik olanlardan yaklaşık 1000 kat daha yüksektir. Bu durumda, analitin kendisi floresan yaymıyorsa, ya kendi floresansı ya da karşılık gelen türevlerin floresansı kullanılır. Modern
Değiştirilebilir floresan dedektörler, yalnızca kromato-
gram, aynı zamanda analizin uyarma ve floresan spektrumlarını kaydetmek için
zlenebilir bağlantılar.
Refraktometrik dedektörler, spektrumun UV ve görünür bölgelerinde (örneğin karbonhidratlar) absorbe etmeyen numuneleri analiz etmek için kullanılır.
(refraktometreler). Bu dedektörlerin dezavantajları, (spektrofotometrik dedektörlere kıyasla) düşük hassasiyetleri ve sinyal yoğunluğunun önemli ölçüde sıcaklığa bağımlılığıdır (dedektör termostatlı olmalıdır).
Elektrokimyasal dedektörler de kullanılır (kondüktometrik
gökyüzü, amperometrik, vb.), kütle spektrometrik ve Fourier-IR
dedektörler, ışık saçılım dedektörleri, radyoaktivite ve diğer bazı
mobil aşama
AT PF olarak hem bireysel hem de karışımları olmak üzere çeşitli çözücüler kullanılabilir.
AT normal faz Kromatografi genellikle sıvı karbon kullanır
hidrokarbonlar (heksan, sikloheksan, heptan) ve diğer nispeten polar olmayan
küçük polar organik bileşikler ilaveli çözücüler,
PF'nin ayrıştırma gücünü düzenleyen.
Ters fazlı kromatografide, PF'nin bileşimi polar veya-
organik çözücüler (genellikle asetonitril ve metanol) ve su. için opti-
Ayırma çalışmaları genellikle belirli bir işarete sahip sulu çözeltiler kullanır.
pH değeri, özellikle tampon çözeltileri. İnorganik katkı maddeleri kullanılır
kalik ve organik asitler, bazlar ve tuzlar ve diğer bileşikler (on-
örneğin, enantiyomerleri aşiral olarak ayırmak için kiral değiştiriciler
ad sorbent).
pH değerinin kontrolü, organik bir çözücü ile karışımı için değil, sulu bileşen için ayrı olarak gerçekleştirilmelidir.
PF, gerekirse bir, genellikle iki çözücüden oluşabilir.
dimity - üç veya daha fazla. PF'nin bileşimi, onu oluşturan çözücülerin hacim oranı olarak belirtilir. Bazı durumlarda, kütle
özel olarak belirtilmesi gereken oran.
Bir UV spektrofotometrik dedektörü kullanırken, PF, algılama için seçilen dalga boyunda belirgin bir absorpsiyona sahip olmamalıdır. Belirlerken şeffaflık veya optik yoğunluk sınırı
belirli bir üreticinin çözücünün belirtilen dalga boyu genellikle belirtilir
paketin üzerindedir.
Kromatografik analiz, PF'nin saflık derecesinden büyük ölçüde etkilenir, bu nedenle üretilen solventlerin kullanılması tercih edilir.
sıvı kromatografi (su dahil) için özel olarak nye.
PF ve analiz edilen çözeltiler çözülmemiş içermemelidir
parçacıklar ve gaz kabarcıkları. Laboratuvarda elde edilen su
su organik çözücüler ile önceden karıştırılmış sulu çözeltiler
Çözücüler ve ayrıca analiz edilen çözeltiler, ince filtrasyona ve gazdan arındırmaya tabi tutulmalıdır. Filtreleme genellikle bu amaç için kullanılır.
Bu solvente veya 0.45 um gözenek boyutuna sahip çözeltiye göre inert bir membran filtreden vakum altında.
Veri toplama ve işleme sistemi
Modern bir veri işleme sistemi, konjuge bir
Yazılımın yüklü olduğu kromatografa bağlı kişisel bilgisayar
kaydetmenizi ve krono-işlemenizi sağlayan yazılım
matogramın yanı sıra kromatografın çalışmasını yönetmek ve ana
kromatografik sistemin mi parametreleri.
Belirtilecek kromatografik koşulların listesi
Özel bir monografta, ortak
kolonlar, partikül boyutunu gösteren sorbent tipi, kolon sıcaklığı (sıcaklık kontrolü gerekliyse), enjekte edilen numunenin hacmi (döngü hacmi),
PF durumu ve hazırlanma yöntemi, PF besleme hızı, dedektör ve algılama koşulları, gradyan modunun tanımı (kullanılıyorsa), kromatografi süresi.
İYON DEĞİŞİMİ VE İYON HPLC
Organik olarak analiz için iyon değişim kromatografisi kullanılır.
skikh (heterosiklik bazlar, amino asitler, proteinler, vb.) ve non-or-
ganik (çeşitli katyonlar ve anyonlar) bileşikleri. Bileşenlerin ayrılması
iyon değişim kromatografisinde analiz edilen karışımın bileşenleri, analiz edilen maddelerin iyonlarının iyonik gruplarla tersinir etkileşimine dayanır.
pami sorbenti. Sorbent olarak anyon değiştiriciler veya katyon değiştiriciler kullanılır.
sen. Bu sorbentler esas olarak ya polimerik iyon-
değişim reçineleri (genellikle greftli stiren ve divinilbenzen kopolimerleri)
iyonik gruplar) veya aşılanmış iyon değişim grupları ile silika jeller. -(CH2)3 N+ X– gruplu sorbentler anyonları ayırmak için, -(CH2)SO3 – H+ gruplu sorbentler ise katyonları ayırmak için kullanılır.
Tipik olarak, polimer reçineleri, anyonları ayırmak ve e-'yi ayırmak için kullanılır.
katyonlar modifiye silika jellerdir.
İyon değişim kromatografisinde PF olarak asitlerin, bazların ve tuzların sulu çözeltileri kullanılır. Tampon yarışlar genellikle kullanılır
belirli pH değerlerini korumanıza izin veren çözümler. Suyla karışabilen organik katkı maddelerinin küçük katkı maddelerinin kullanılması da mümkündür.
kal çözücüler - asetonitril, metanol, etanol, tetrahidrofuran.
iyon kromatografisi- iyon değişim kromatografisinin bir çeşidi,
analitin iyonlarının konsantrasyonunu belirlemek için kullanılan
bir kondüktometrik dedektör kullanarak. Son derece hassas işlemler için
PF dedektöründen geçen elektriksel iletkenlikteki değişiklikleri belirlemek için PF'nin arka plan elektrik iletkenliği düşük olmalıdır.
İyon kromatografisinin iki ana çeşidi vardır.
Bunlardan ilki, elektrolitik maddenin elektriksel iletkenliğinin bastırılmasına dayanmaktadır.
bu PF, anal arasında bulunan ikinci iyon değişim sütununu kullanarak
litik kolon ve dedektör. Bu sütunda nötralizasyon gerçekleşir.
PF ve analiz edilen bileşikler deiyonizasyonda dedektör hücresine girer
sirovannoy su. Tespit edilen iyonlar tek iyonlardır.
PF'nin iletkenliğini sağlamak. Bastırıcı kolonun dezavantajı, oldukça kısa aralıklarla yenilenmesi ihtiyacıdır.
ben. Bastırma sütunu, sürekli çalışan bir
zarın bileşiminin sürekli olduğu zar baskılayıcı
yönde hareket eden yenileyici çözeltinin akışıdır
PF akış yönünün tersi.
İyon kromatografisinin ikinci versiyonu, tek sütunlu iyon kromatografisidir.
matografi. Bu varyantta, çok düşük elektrik iletkenliğine sahip bir PF kullanılır.
su içeriği. Zayıf organik bileşikler elektrolit olarak yaygın olarak kullanılmaktadır.
gökyüzü asitleri - benzoik, salisilik veya izoftalik.
BOYUT HPLC
Boyut dışlama kromatografisi (jel kromatografisi), moleküllerin boyutlarına göre ayrılmasına dayanan özel bir HPLC versiyonudur. Dağıtım
Sabit ve hareketli fazlar arasındaki moleküller, molekülün boyutuna bağlıdır.
moleküller ve kısmen şekilleri ve polariteleri. Ayırma için kullanın
gözenekli emiciler - polimerler, silika jel, gözenekli camlar ve polisakaritler.
Sorbentlerin partikül boyutu 5-10 µm'dir.
Gözenekli camların ve silika jelin avantajları, PF ve analit moleküllerinin gözeneklere hızlı difüzyonu, çeşitli koşullar altında (yüksek sıcaklıklarda bile) stabilitedir. polimerik sorben-
siz stiren ve divinilbenzenin kopolimerlerisiniz (bu bir hidro-
polar olmayan mobil fazlar ile kullanılan fobik sorbentler) ve
sülfonatlı divinilbenzen veya poliakrilamid reçinelerinden elde edilen hidrofilik jeller.
Gözenekli durağan faz ile moleküllerin iki sınırlayıcı etkileşimi mümkündür. Ortalama bir gözenek çapından daha büyük moleküller, sorbent içine hiç nüfuz etmez ve hareketli faz ile birlikte ayrıştırılır.
önce zo. Türün gözenek boyutundan çok daha küçük bir çapa sahip moleküller
kıvrımlar serbestçe içine nüfuz eder, en uzun süre sabit fazda kalır ve en son elute edilir. Orta büyüklükteki moleküller, boyutlarına bağlı olarak ve kısmen şekillerine bağlı olarak sorbentin gözeneklerine nüfuz eder. arasında farklı alıkonma süreleri ile elute edilirler.
en büyük ve en küçük moleküllerimiz. Kromatografiye tabi tutulan numunenin bileşenlerinin ayrılması, tekrarlanan ak-
numune bileşenlerinin emici maddenin gözeneklerine difüzyonu ve bunun tersi.
Boyut dışlama kromatografisinde, retansiyonu karakterize etmek için,
PF akış hızının ürününe eşit bir tutma hacmi ve tutma süresi kullanılır.
mobil aşama. PF seçimi sorbent tipine bağlıdır. Dışlama-
kromatografi genellikle jel filtrasyonu ve jel kromatografisi olarak ikiye ayrılır.
geçirgenlik kromatografisi.
ayırmak için jel filtrasyon kromatografi yöntemi kullanılır.
hidrofilik sorbentler üzerinde suda çözünür bileşiklerin Mobil fazlar, belirli bir pH değerine sahip sulu tampon çözeltilerdir.
Jel geçirgenlik kromatografisi hidrofobik kullanır
kıvrımlar ve polar olmayan organik çözücüler (toluen, diklorometan, tetra-
hidrofuran). Bu yöntem, az çözünür olan bileşikleri analiz etmek için kullanılır.
su ile çevrili.
Dedektörler. Boyut dışlama kromatografisinde dedektörler olarak, diferansiyel refraktometrik dedektörlerin yanı sıra spektrofotometrik dedektörler (spektrumun IR bölgesindekiler dahil) kullanılır.
Viskometrik ve akış lazer dedektörleri de kullanılmaktadır.
Bu dedektörler, bir refraktometre veya başka bir konsantrasyon ile birlikte
dedektör sürekli olarak belirlemenizi sağlar moleküler ağırlıküzerinde-
PF'de kireç.
ULTRA PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ
Ultra performanslı sıvı kromatografisi, daha verimli olan sıvı kromatografisinin bir çeşididir.
stu klasik HPLC ile karşılaştırıldığında.
Ultra performanslı sıvı kromatografisinin bir özelliği,
1.5 ila 2 mikron partikül boyutuna sahip sorbentlerin kullanımı. krom
matografik sütunlar genellikle 50 ila 150 mm uzunluğunda ve 1
4 mm çapa kadar. Enjekte edilen numunenin hacmi 1 ila 50 µl arasında olabilir.
Klasikte kullanılan kromatografik ekipman
riante HPLC, genellikle bu tip kromatografi için özel olarak uyarlanmıştır
Ultra performanslı sıvı kromatografisi için tasarlanmış ekipman, HPLC'nin klasik versiyonunda da kullanılabilir.
GENEL FARMAKOPEAN YETKİLENDİRMESİ
Sanat Yerine. GF XI
Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (yüksek basınçlı sıvı kromatografisi), hareketli fazın, sabit bir faz (sorbent) ile dolu bir kromatografik kolon boyunca hareket eden bir sıvı olduğu bir kolon kromatografi yöntemidir. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi için sütunlar, girişte yüksek hidrolik direnç ile karakterize edilir.
Maddelerin ayrılma mekanizmasına bağlı olarak, aşağıdaki yüksek performanslı sıvı kromatografi varyantları ayırt edilir: ana tezahür eden moleküller arası etkileşimlerin doğasına göre adsorpsiyon, bölme, iyon değişimi, dışlama, kiral vb. Adsorpsiyon kromatografisinde, maddelerin ayrılması, gelişmiş bir yüzeye, örneğin silika jele sahip bir sorbent yüzeyinden adsorbe olma ve desorbe olma konusundaki farklı yetenekleri nedeniyle meydana gelir. Bölme yüksek performanslı sıvı kromatografisinde, sabit (kural olarak, sabit bir taşıyıcının yüzeyine kimyasal olarak aşılanmış) ve hareketli fazlar arasında ayrılacak maddelerin dağılım katsayılarındaki fark nedeniyle ayırma meydana gelir.
Hareketli ve durağan fazın tipine bağlı olarak normal faz ve ters faz kromatografisi ayırt edilir. Normal fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisinde, sabit faz polardır (çoğunlukla silika jel veya aşılanmış NH2 - veya CN grupları ile silika jel vb.) ve hareketli faz polar değildir (heksan veya bunların karışımları). daha polar organik çözücüler içeren heksan - kloroform, alkoller, vb.). Maddelerin tutulması artan polarite ile artar. Normal faz kromatografisinde, artan polarite ile mobil fazın ayrıştırma gücü artar.
Ters fazlı kromatografide, sabit faz polar değildir (aşılanmış C4, C8, C18 grupları, vb. ile hidrofobik silika jeller); hareketli faz polardır (su ve polar çözücülerin karışımları: asetonitril, metanol, tetrahidrofuran, vb.). Maddelerin tutulması, hidrofobikliklerindeki (polaritesizlik) artışla artar. Organik çözücünün içeriği ne kadar yüksek olursa, mobil fazın yıkama gücü o kadar yüksek olur.
İyon değişim kromatografisinde, çözeltide katyonlara ve anyonlara ayrışan karışım maddelerinin molekülleri, sorbent (katyon değiştirici veya anyon değiştirici) boyunca hareket ederken, iyonların etkileşiminin farklı kuvvetleri nedeniyle ayrılır. sorbentin iyonik grupları ile belirlenir.
Boyut dışlama (elek, jel nüfuz eden, jel süzme) kromatografisinde, maddelerin molekülleri, sabit fazın gözeneklerine farklı nüfuz etme yeteneklerinden dolayı boyutlarına göre ayrılır. Bu durumda, durağan fazın minimum sayıdaki gözeneklerine nüfuz edebilen en büyük moleküller kolondan ilk ayrılanlardır ve küçük molekül boyutlarına sahip maddeler en son ayrılanlardır.
Kiral kromatografide, optik olarak aktif bileşikler, ayrı enantiyomerlere ayrılır. Ayırma, kiral sabit fazlar üzerinde veya kiral hareketli fazlar kullanılarak aşiral sabit fazlar üzerinde gerçekleştirilebilir.
Yüksek performanslı sıvı kromatografisi için başka seçenekler de vardır.
ayırma genellikle tek bir mekanizma tarafından değil, hareketli ve durağan fazların tipine ve ayrıca belirlenen bileşiğin doğasına bağlı olarak aynı anda birkaç mekanizma ile gerçekleşir.
Uygulama alanı
Yüksek performanslı sıvı kromatografisi, "Kimlik", "Yabancı safsızlıklar", "Çözünme", "Dozlamanın tekdüzeliği", "Kantitatif belirleme" testlerinde ilaçların hem kalitatif hem de kantitatif analizi için başarıyla kullanılmaktadır. Kromatografinin, "Kimlik" ve "Kantitatif belirleme" dahil olmak üzere birkaç testi tek bir numunede birleştirmenize izin verdiğine dikkat edilmelidir.
Teçhizat
Analiz için uygun aletler kullanılır - sıvı kromatograflar.
Bir sıvı kromatografın bileşimi genellikle aşağıdaki ana bileşenleri içerir:
- mobil fazlı bir kap (veya mobil fazın parçası olan ayrı çözücüler içeren kaplar) ve mobil fazın gazının alınması için bir sistem içeren bir mobil faz hazırlama ünitesi;
- pompalama sistemi;
– mobil fazlı karıştırıcı (gerekirse);
– numune enjeksiyon sistemi (enjektör), manuel veya otomatik olabilir (otomatik numune alıcı);
— kromatografik kolon (bir termostata monte edilebilir);
— dedektör (farklı algılama yöntemlerine sahip bir veya daha fazla);
— kromatograf kontrol sistemi, veri toplama ve işleme.
Ek olarak, kromatograf şunları içerebilir: bir numune hazırlama sistemi ve bir kolon öncesi reaktör, bir kolon değiştirme sistemi, bir kolon sonrası reaktör ve diğer ekipman.
pompalama sistemi
Pompalar, hareketli fazı kolona önceden belirlenmiş bir oranda besler. Hareketli fazın bileşimi ve akış hızı analiz sırasında sabit veya değişebilir. Mobil fazın sabit bir bileşimi durumunda, sürece izokratik ve ikinci gradyan denir. Modern bir sıvı kromatograf pompalama sistemi, bir veya daha fazla bilgisayar kontrollü pompadan oluşur. Bu, gradyan elüsyonu sırasında mobil fazın kompozisyonunu belirli bir programa göre değiştirmenize olanak sağlar. Analitik yüksek performanslı sıvı kromatografisi için pompalar, 40 MPa'ya kadar bir kolon giriş basıncında, hareketli fazın kolona akış hızının 0.1 ila 10 ml/dak aralığında tutulmasına izin verir. Pompaların tasarımında yer alan özel damper sistemleri ile basınç titreşimleri en aza indirilmiştir. Pompaların çalışma parçaları, hareketli fazın bileşiminde agresif bileşenlerin kullanılmasına izin veren korozyona dayanıklı malzemelerden yapılmıştır.
Musluklar
Karıştırıcıda, gerekli karışım önceden hazırlanmamışsa, pompalar tarafından sağlanan ayrı ayrı çözücülerden tek bir hareketli faz oluşturulur. Mobil faz bileşenlerinin mikserde karıştırılması hem düşük basınçta (pompalardan önce) hem de yüksek basınçta (pompalardan sonra) gerçekleşebilir. Karıştırıcı, mobil faz hazırlama ve izokratik elüsyon için kullanılabilir.
Karıştırıcının hacmi, gradyan elüsyonunda bileşenlerin alıkonma süresini etkileyebilir.
enjektörler
Enjektörler, enjekte edilen numunenin hacmini değiştirme yeteneği ile evrensel veya yalnızca belirli bir hacimdeki bir numuneyi vermek için ayrık olabilir. Her iki enjektör türü de otomatik olabilir ("otomatik enjektörler" veya "otomatik numune alıcılar"). Numune enjektörü (çözelti) doğrudan kromatografik kolonun önüne yerleştirilmiştir. Enjektörün tasarımı, mobil fazın akış yönünü değiştirmeyi ve belirli bir hacimdeki (genellikle 10 ila 100 µl) dozlama döngüsüne veya özel bir değişkene numunenin ön enjeksiyonunu gerçekleştirmeyi mümkün kılar. hacim dozaj cihazı. Döngünün hacmi, işaretinde belirtilmiştir. Ayrı bir enjektörün tasarımı, kural olarak, döngünün değiştirilmesine izin verir. Modern otomatik enjektörler bir dizi Ek özelliklerörneğin, bir numune hazırlama istasyonunun işlevini yerine getirmek için: numuneleri karıştırmak ve seyreltmek, bir kolon öncesi türevlendirme reaksiyonu yürütmek.
kromatografi sütunu
Kromatografik kolonlar genellikle paslanmaz çelik, cam veya bir sorbent ile doldurulmuş ve her iki tarafı 2-5 µm gözenek çapına sahip filtrelerle kapatılmış plastik tüplerdir. Analitik kolonun uzunluğu 5 ila 60 cm veya daha fazla olabilir, iç çap 2 ila 10 mm arasındadır. Mikrokolon kromatografisinde iç çapı 2 mm'den küçük olan kolonlar kullanılır. İç çapı yaklaşık 0,3-0,7 mm olan kılcal kolonlar da vardır. Hazırlayıcı kromatografi için sütunların iç çapı 50 mm veya daha fazla olabilir.
Analitik sütundan önce, ana analitik sütunun korunması olan çeşitli yardımcı işlevleri yerine getiren kısa sütunlar (ön sütunlar) kurulabilir. Tipik olarak, analiz oda sıcaklığında gerçekleştirilir, ancak ayırma verimliliğini artırmak ve analizin süresini kısaltmak için kolonların 80–100 °C'ye kadar sıcaklıklarda termostatlanması kullanılabilir. Ayırma sırasında yüksek bir sıcaklık kullanma olasılığı, yüksek sıcaklıklarda yıkımı mümkün olduğundan, durağan fazın stabilitesi ile sınırlıdır.
Sabit faz (sorbent)
Yaygın olarak kullanılan sorbentler şunlardır:
- silika jel, alümina, normal faz kromatografisinde kullanılır. Bu durumda tutma mekanizması genellikle adsorpsiyondur;
- aşılı asidik veya bazik gruplara sahip silika jel, reçineler veya polimerler. Kapsam - iyon değişimi ve iyon kromatografisi;
- belirli bir gözenek boyutu dağılımına sahip silika jel veya polimerler (boyut dışlama kromatografisi);
- kimyasal olarak değiştirilmiş sorbentler (bağlı faz sorbentleri), çoğunlukla silika jel bazında hazırlanır. Tutma mekanizması, hareketli ve sabit fazlar arasında adsorpsiyon veya dağılımdır. Kapsam, aşılanmış fonksiyonel grupların tipine bağlıdır. Bazı sorbent türleri hem ters hem de normal faz kromatografisinde kullanılabilir;
- kimyasal olarak değiştirilmiş kiral sorbentler, örneğin, selüloz ve amiloz türevleri, proteinler ve peptitler, siklodekstrinler, enantiyomerleri ayırmak için kullanılan kitozanlar (kiral kromatografi).
Bağlı faz sorbentleri, değişen derecelerde kimyasal modifikasyona sahip olabilir. En yaygın olarak kullanılan bağlı fazlar şunlardır:
– oktadesil grupları (sorbent oktadesilsilan (ODS) veya C 18);
– oktil grupları (sorbent oktilsilan veya C 8);
– fenil grupları (fenilsilan emici);
– siyanopropil grupları (CN emici);
– aminopropil grupları (NH2 sorbent);
– diol grupları (sorbent diol).
Çoğu zaman, analiz, bir C 18 sorbent kullanılarak ters faz modunda polar olmayan bağlı fazlar üzerinde gerçekleştirilir.
Silika jel bazlı bağlı faz sorbentleri, üretici tarafından aksi belirtilmedikçe, 2,0 ila 7,0 pH değerlerinde kimyasal olarak stabildir. Emici partiküller, küresel veya düzensiz bir şekle ve çeşitli gözenekliliğe sahip olabilir. Analitik yüksek performanslı sıvı kromatografisinde sorbentin partikül boyutu genellikle 3-10 µm'dir, hazırlayıcı yüksek performanslı sıvı kromatografisinde ise 50 µm veya daha fazladır. Emici maddenin, kolonun tüm hacmini dolduran gözeneklere sahip bir monolit olduğu monolitik kolonlar da vardır.
Yüksek ayırma verimliliği, emici parçacıkların yüksek yüzey alanı (mikroskobik boyutlarının ve gözeneklerin varlığının bir sonucudur) ve ayrıca emici bileşimin tek biçimliliği ve yoğun ve tek biçimli ambalajı ile sağlanır.
dedektörler
Yüksek performanslı sıvı kromatografisinde çeşitli tespit yöntemleri kullanılmaktadır. Genel durumda, kromatografik kolondan sonra içinde çözünmüş bileşenlere sahip mobil faz, özelliklerinden birinin veya diğerinin sürekli olarak ölçüldüğü dedektör hücresine girer (spektrumun ultraviyole veya görünür bölgesinde absorpsiyon, floresan, kırılma indeks, elektriksel iletkenlik, vb.). Ortaya çıkan kromatogram, mobil fazın bazı fiziksel veya fiziko-kimyasal parametrelerinin zamana bağımlılığının bir grafiğidir.
Yüksek performanslı sıvı kromatografisinde en yaygın dedektörler spektrofotometriktir. Maddelerin özel olarak tasarlanmış bir mikro hücrede elüsyonu sırasında, elüatın optik yoğunluğu önceden seçilmiş bir dalga boyunda ölçülür. Dedektörün geniş doğrusallık aralığı, bir karışımın hem safsızlıklarını hem de ana bileşenlerini tek bir kromatogram üzerinde analiz etmeyi mümkün kılar. Bir spektrofotometrik dedektör, çalışma aralığındaki (tipik olarak 190-600 nm) herhangi bir dalga boyunda algılamaya izin verir. Aynı anda birkaç dalga boyunda algılamaya izin veren çok dalgalı dedektörler ve tüm çalışma dalga boyu aralığında (genellikle 190-950 nm) optik yoğunluğun eşzamanlı olarak kaydedilmesine izin veren bir diyot matrisi üzerindeki dedektörler de kullanılır. Bu, dedektör hücresinden geçen bileşenlerin absorpsiyon spektrumlarının kaydedilmesini mümkün kılar.
Florimetrik dedektör, floresan bileşikleri veya floresan türevleri biçiminde floresan olmayan bileşikleri tespit etmek için kullanılır. Bir florimetrik dedektörün çalışma prensibi, emilen ışığın floresan emisyonunun ölçülmesine dayanır. Absorpsiyon genellikle spektrumun ultraviyole bölgesinde gerçekleştirilir, flüoresan radyasyonun dalga boyları, emilen ışığın dalga boylarını aşar. Florometrik dedektörler çok yüksek hassasiyet ve seçiciliğe sahiptir. Floresan dedektörlerin hassasiyeti, spektrofotometrik olanlardan yaklaşık 1000 kat daha yüksektir. Modern floresan dedektörler, yalnızca kromatogramların elde edilmesini değil, aynı zamanda analiz edilen bileşiklerin eksitasyon ve floresan spektrumlarının kaydedilmesini de mümkün kılar.
Spektrumun ultraviyole ve görünür bölgelerinde (örneğin karbonhidratlar) zayıf emen bileşikleri belirlemek için kullanın. refraktometrik dedektörler (refraktometreler). Bu dedektörlerin dezavantajları, düşük (spektrofotometrik dedektörlere kıyasla) hassasiyetleri ve sinyal yoğunluğunun önemli ölçüde sıcaklığa bağımlılığı (detektör termostatlı olmalıdır) ve bunları gradyan elüsyon modunda kullanmanın imkansızlığıdır.
Çalışma prensibi buharlaşmalı lazer ışık saçılım dedektörleri hareketli fazı oluşturan kromatografik çözücülerin ve analiz edilen maddelerin buhar basınçlarındaki farka dayanır. Kolonun çıkışındaki hareketli faz, nitrojen veya CO2 ile karıştırılarak nebülizöre verilir ve ince bir şekilde dağılmış bir aerosol formunda 30–160 °C sıcaklığa sahip ısıtılmış bir buharlaştırıcı tüpe girer; mobil faz buharlaşır. Analiz edilen maddelerin uçucu olmayan partiküllerinden oluşan bir aerosolü, ışık akısını dispersiyon odasında dağıtır. Işık akısının dağılma derecesine göre, belirlenen bileşiğin miktarı yargılanabilir. Dedektör, refraktometrik olandan daha hassastır, sinyali numunenin optik özelliklerine, analitlerdeki fonksiyonel grupların tipine, mobil fazın bileşimine bağlı değildir ve gradyan elüsyon modunda kullanılabilir. .
Elektrokimyasal dedektörler (kondüktometrik, amperometrik, kulometrik vb.). Katı bir elektrotun yüzeyinde oksitlenebilen veya indirgenebilen elektroaktif bileşikleri tespit etmek için bir amperometrik dedektör kullanılır. Analitik sinyal, oksidasyon veya indirgeme akımının büyüklüğüdür. Dedektör hücresinin en az iki elektrotu vardır - bir çalışma elektrotu ve bir referans elektrotu (gümüş klorür veya çelik). Elektrotlara, değeri belirlenen bileşiklerin doğasına bağlı olan bir çalışma potansiyeli uygulanır. Çalışma elektrotunun potansiyelindeki değişiklik profili bir sinyal kaydı döngüsü sırasında ayarlandığında, ölçümler hem sabit potansiyelde hem de darbeli modda gerçekleştirilebilir. Amperometrik dedektör, karbon malzemelerden (çoğunlukla camsı karbon veya grafit) ve metalden yapılmış çalışma elektrotlarını kullanır: platin, altın, bakır, nikel.
İyon kromatografisinde anyonları ve katyonları tespit etmek için bir kondüktometrik dedektör kullanılır. Çalışma prensibi, bir maddenin elüsyonu sırasında mobil fazın elektriksel iletkenliğinin ölçülmesine dayanır.
Son derece bilgilendirici, yüksek hassasiyet ve seçiciliğe sahip kütle spektrometrik dedektörüdür. Sıvı kromatografisi için en son kütle spektrometresi modelleri, 20 ila 4000 amu arasında m/z kütle aralığında çalışır.
Yüksek performanslı sıvı kromatografisi ayrıca Fourier-IR dedektörleri, radyoaktivite ve diğer bazılarını kullanır.
Veri toplama ve işleme sistemi
Modern bir veri işleme sistemi, kromatogramı kaydetmenize ve işlemenize, ayrıca kromatografın çalışmasını kontrol etmenize ve kromatografik sistemin ana parametrelerini izlemenize olanak tanıyan yüklü yazılımla kromatografa bağlı bir kişisel bilgisayardır.
mobil aşama
Yüksek performanslı sıvı kromatografisinde hareketli faz ikili bir işlevi yerine getirir: desorbe olmuş moleküllerin kolon boyunca transferini sağlar ve denge sabitlerini düzenler ve sonuç olarak durağan faz (yüzeyde emilir) ile etkileşimin bir sonucu olarak alıkonmayı düzenler. ) ve maddelerin moleküllerinin ayrılması ile. Bu nedenle, yüksek performanslı sıvı kromatografisinde mobil fazın bileşimini değiştirerek, bileşiklerin alıkonma sürelerini, seçiciliklerini ve ayrılmalarının verimliliğini etkileyebilir.
Mobil faz bir solventten, genellikle iki, gerekirse üç veya daha fazla solventten oluşabilir. Mobil fazın bileşimi, onu oluşturan çözücülerin hacim oranı olarak belirtilir. Bazı durumlarda, özel olarak belirtilmesi gereken kütle oranı belirtilebilir. Belirli bir pH değerine sahip tampon çözeltiler, çeşitli tuzlar, asitler ve bazlar ve diğer değiştiriciler, mobil fazın bileşenleri olarak kullanılabilir.
Normal faz kromatografisi genellikle sıvı hidrokarbonlar (heksan, sikloheksan, heptan) ve hareketli fazın ayrıştırma gücünü kontrol eden küçük polar organik bileşik ilaveleri ile nispeten polar olmayan diğer çözücüleri kullanır.
Ters faz kromatografisinde hareketli faz olarak su veya sulu-organik karışımlar kullanılır. Organik katkı maddeleri genellikle polar organik çözücülerdir (asetonitril ve metanol). Ayırmayı optimize etmek için, belirli bir pH değerine sahip sulu çözeltiler, özellikle tampon çözeltiler ve ayrıca mobil faza çeşitli katkı maddeleri kullanılabilir: asidik bileşiklerin ayrılmasında fosforik ve asetik asitler; bazik bileşiklerin ayrılmasında amonyak ve alifatik aminler ve diğer değiştiriciler.
Mobil fazın saflığı kromatografik analizi büyük ölçüde etkiler, bu nedenle sıvı kromatografisi (su dahil) için özel olarak salınan solventlerin kullanılması tercih edilir.
Bir UV spektrofotometrik dedektörü kullanırken, mobil faz, algılama için seçilen dalga boyunda belirgin bir absorpsiyona sahip olmamalıdır. Belirli bir üreticinin solventinin belirli bir dalga boyunda şeffaflık veya optik yoğunluk sınırı genellikle ambalaj üzerinde belirtilir.
Mobil faz ve analiz edilen solüsyonlar, çözünmemiş partiküller ve gaz kabarcıkları içermemelidir. Laboratuvar koşullarında elde edilen su, sulu çözeltiler, önceden suyla karıştırılmış organik çözücüler ve ayrıca analiz edilen çözeltiler ince filtrasyona ve gazdan arındırmaya tabi tutulmalıdır. Bu amaçlar için, genellikle belirli bir çözücü veya çözeltiye göre inert olan 0.45 um gözenek boyutuna sahip bir membran filtreden vakumla süzme kullanılır.
Belirtilecek kromatografik koşulların listesi
Monograf şunları içermelidir: üreticiyi ve katalog numarasını gösteren sütunun tam ticari adı, sütun boyutları (uzunluk ve iç çap), sorbent türü, parçacık boyutunu, gözenek boyutunu, sütun sıcaklığını (sıcaklık kontrolü gerekliyse) belirten , enjekte edilen numunenin hacmi (hacim döngüleri), mobil faz bileşimi ve hazırlanma yöntemi, mobil faz besleme hızı, dedektör tipi ve algılama koşulları (gerekirse, kullanılan dedektör hücresinin parametreleri), gradyan modunun açıklaması (eğer varsa) kullanılan), başlangıç koşullarına yeniden dengeleme aşaması, kromatografi süresi, Detaylı Açıklama yöntemler ve hesaplama formülleri, standart ve test çözeltilerinin hazırlanmasının açıklamaları.
Otomatik örnekleyicide sütun öncesi türevlendirme kullanılıyorsa, otomatik örnekleyici programı hakkında bilgi verilir. Kolon sonrası türevlendirme kullanılması durumunda, türevlendirme reaktifinin besleme hızı, karıştırma döngüsünün hacmi ve sıcaklığı belirtilir.
Modifiye Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi
iyon çifti kromatografisi
Ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisinin çeşitlerinden biri, iyonize bileşikleri belirlemenizi sağlayan iyon çifti kromatografisidir. Bunu yapmak için, mobil fazın geleneksel ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisine iyonojenik gruplara (iyon çifti reaktifleri) sahip hidrofobik organik bileşikler eklenir. Sodyum alkil sülfatlar genellikle bazları ayırmak için kullanılır, asitleri ayırmak için tetraalkilamonyum tuzları (tetrabütilamonyum fosfat, setiltrimetilamonyum bromür vb.) kullanılır. İyon çifti modunda, iyonik olmayan bileşenlerin ayrılmasının seçiciliği, ters faz tutma mekanizması ile sınırlandırılırken, bazların ve asitlerin tutulması belirgin şekilde artarken kromatografik tepe noktalarının şekli iyileşir.
İyon çifti rejiminde tutma, birbiriyle rekabet eden oldukça karmaşık denge süreçlerinden kaynaklanmaktadır. Bir yandan, hidrofobik etkileşimler ve hareketli fazın polar ortamının yer değiştirmesinin etkisi nedeniyle, hidrofobik iyonların alkil silika jel yüzeyi üzerinde sorpsiyonu, yüklü gruplar mobil faza bakacak şekilde mümkündür. Bu durumda, yüzey iyon değiştirme özelliklerini kazanır ve tutma, iyon değiştirme kromatografisi yasalarına uyar. Öte yandan, eluent hacminde doğrudan bir iyon çifti oluşturmak ve ardından ters faz mekanizmasıyla sorbent üzerinde emilmesi mümkündür.
Hidrofilik etkileşim kromatografisi ( HILIK kromatografi)
Hidrofilik etkileşim kromatografisi, ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisinde zayıf şekilde tutulan polar bileşikleri ayırmak için kullanılır. Bu kromatografi varyantında mobil faz olarak, tuzların, asitlerin veya bazların ilave edildiği su-asetonitril karışımları kullanılır. Sabit fazlar, kural olarak, polar gruplarla (amino, diol, siyanopropil grupları, vb.) Değiştirilmiş silika jellerdir. Daha polar bileşikler daha güçlü tutulur. Artan polarite ile mobil fazın ayrıştırma gücü artar.
İyon değişimi ve iyon yüksek performanslı sıvı kromatografisi
İyon değişim kromatografisi hem organik (heterosiklik bazlar, amino asitler, proteinler, vb.) hem de inorganik (çeşitli katyonlar ve anyonlar) bileşikleri analiz etmek için kullanılır. İyon değişim kromatografisinde analiz edilen karışımın bileşenlerinin ayrılması, analiz edilen maddelerin iyonlarının sorbentin iyon değişim grupları ile tersinir etkileşimine dayanır. Bu sorbentler esas olarak ya polimerik iyon değişim reçineleri (genellikle aşılanmış iyon değişim grupları ile stiren ve divinilbenzenin kopolimerleri) ya da aşılanmış iyon değişim grupları ile silika jellerdir. Grupları olan sorbentler: -NH 3 +, -R 3 N +, -R 2 HN +, -RH 2 N +, vb., anyonları (anyon değiştiriciler) ve sorbentleri şu gruplarla ayırmak için kullanılır: -SO 3 -, - RSO 3 -, -COOH, -PO 3 - ve katyonların ayrılması için diğerleri (katyon değiştiriciler).
İyon değişim kromatografisinde hareketli faz olarak asitlerin, bazların ve tuzların sulu çözeltileri kullanılır. Tipik olarak, belirli pH değerlerini korumak için tampon çözeltiler kullanılır. Asetonitril, metanol, etanol, tetrahidrofuran gibi suyla karışabilen organik çözücülerin küçük ilavelerini kullanmak da mümkündür.
iyon kromatografisi - analitleri (iyonları) tespit etmek için bir kondüktometrik dedektörün kullanıldığı bir iyon değişim kromatografisi çeşidi. Dedektörden geçen mobil fazın iletkenliğindeki değişikliklerin oldukça hassas bir şekilde belirlenmesi için mobil fazın arka plan iletkenliği düşük olmalıdır.
İyon kromatografisinin iki ana çeşidi vardır.
Bunlardan ilki olan iki kolonlu iyon kromatografisi, ikinci bir iyon değişim kolonu veya analitik kolon ile dedektör arasına yerleştirilmiş özel bir membran bastırma sistemi kullanılarak mobil faz elektrolitinin elektriksel iletkenliğinin bastırılmasına dayanır. Sistemden geçerken mobil fazın elektriksel iletkenliği azalır.
İyon kromatografisinin ikinci çeşidi, tek sütunlu iyon kromatografisidir. Bu varyant, çok düşük elektrik iletkenliğine sahip bir mobil faz kullanır. Elektrolitler yaygın olarak zayıf organik asitler olarak kullanıldığından: benzoik, salisilik veya izoftalik.
Boyut Dışlama Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi
Boyut dışlama kromatografisi (jel kromatografisi), moleküllerin boyutlarına göre ayrılmasına dayanan yüksek performanslı sıvı kromatografisinin özel bir versiyonudur. Moleküllerin sabit ve hareketli fazlar arasındaki dağılımı, moleküllerin boyutuna ve kısmen de şekillerine ve polaritelerine bağlıdır.
Gözenekli durağan faz ile moleküllerin iki sınırlayıcı etkileşimi mümkündür. Maksimum gözenek çapından daha büyük moleküller hiç tutulmaz ve ilk önce hareketli faz ile birlikte hareket ederek ayrıştırılır. Emici maddenin minimum gözenek çapından daha küçük boyutlara sahip moleküller, gözeneklere serbestçe nüfuz eder ve kolondan en son çıkanlardır. Ara boyutlara sahip olan kalan moleküller kısmen gözeneklerde tutulur ve elüsyon sırasında boyutlarına göre fraksiyonlara ayrılır ve kısmen şekline bağlı olarak sorbentin gözeneklerine nüfuz eder ve kısmen de sorbentin gözeneklerine nüfuz eder. , şekillerine bağlı olarak. Sonuç olarak, maddeler farklı alıkonma süreleriyle ayrıştırılır.
İyon dışlama kromatografisi
İyon dışlama kromatografisinin mekanizması, iyonize formdaki bileşiklerin iyon değiştirici sorbent üzerinde tutulmadığı, moleküler formdaki bileşiklerin ise gözenekler içindeki sabit ve sulu fazlar arasında dağıldığı etkiye dayanmaktadır. iyon değişim sorbentinin ve sorbent partikülleri arasındaki boşlukta göç eden mobil fazın. Ayırma, çözünmüş bileşikler ve sorbent arasındaki elektrostatik itme, polar ve hidrofobik etkileşimlere dayanır.
Sorbentin yüzeyindeki anyonik gruplar, sabit ve hareketli fazlar arasında yarı geçirgen bir "zar" görevi görür. Negatif yüklü bileşenler, benzer yüklü fonksiyonel gruplar tarafından itildikleri ve kolonun "ölü" (serbest) hacminde elüe edildikleri için sabit mobil faza ulaşmazlar. Moleküler formdaki bileşenler, katyon değiştirici sorbent tarafından "reddedilmez" ve sabit ve hareketli fazlar arasında dağıtılır. Karışımın iyonik olmayan bileşenlerinin tutulma derecesindeki fark, iyonik olmayan bileşenlerin katyon değiştirici sorbentin fonksiyonel grupları ile polar etkileşimlerinin ve iyonik olmayan bileşenlerin non-iyonik bileşenlerle hidrofobik etkileşimlerinin kombinasyonu ile belirlenir. -polar sorbent matrisi.
kiral kromatografi
Kiral kromatografinin amacı optik izomerleri ayırmaktır. Ayırma, kiral sabit fazlar üzerinde veya kiral hareketli fazlar kullanılarak geleneksel akiral sabit fazlar üzerinde gerçekleştirilir. Kiral durağan fazlar olarak, modifiye edilmiş yüzeye sahip sorbentler, kiral merkezleri olan gruplar veya maddeler (kitozanlar, siklodekstrinler, polisakkaritler, proteinler, vb. (kiral seçiciler) kullanılır.Bu durumda, aynı fazlar, mobil fazlar olarak kullanılabilir. normal faz veya ters faz kromatografisi. Enantiyomerlerin ayrılmasını sağlamak için aşiral sabit fazlar kullanıldığında, mobil fazlara kiral değiştiriciler eklenir: kiral metal kompleksleri, nötr kiral ligandlar, kiral iyon çifti reaktifleri, vb.
Ultra performanslı sıvı kromatografisi
Ultra performanslı sıvı kromatografisi, klasik yüksek performanslı sıvı kromatografisinden daha verimli olan sıvı kromatografisinin bir çeşididir.
Ultra performanslı sıvı kromatografisinin bir özelliği, partikül boyutu 1.5 ila 2 µm olan sorbentlerin kullanılmasıdır. Kromatografik kolonlar tipik olarak 50 ila 150 mm uzunluğunda ve 1 ila 4 mm çapındadır. Enjekte edilen numunenin hacmi 1 ila 50 µl arasında olabilir. Bu tür kromatografik kolonların kullanılması, analiz süresini önemli ölçüde azaltabilir ve kromatografik ayırmanın verimliliğini artırabilir. Ancak bu durumda kolon üzerindeki basınç 80–120 MPa'ya ulaşabilir, gerekli dedektör veri toplama frekansı 40–100 Hz'e kadar çıkabilir ve kromatografik sistemin kolon dışı hacmi en aza indirilmelidir. Ultra performanslı sıvı kromatografisinde kullanılan kromatografi ekipmanı ve kolonları, bu tip kromatografinin gereksinimlerini karşılamak için özel olarak uyarlanmıştır.
Ultra performanslı sıvı kromatografisi için tasarlanmış ekipman, klasik yüksek performanslı sıvı kromatografisinde de kullanılabilir.
giriiş
Kromatografik analiz, bir maddenin homojenliği için bir kriterdir: analiz edilen madde herhangi bir kromatografik yöntemle ayrılmamışsa, homojen (katışıksız) olarak kabul edilir.
Kromatografik yöntemler ile diğer fizikokimyasal analiz yöntemleri arasındaki temel fark, benzer özelliklere sahip maddeleri ayırma olasılığıdır. Ayırma işleminden sonra, analiz edilen karışımın bileşenleri herhangi bir kimyasal, fiziksel ve fiziko-kimyasal yöntemle tanımlanabilir (doğayı ayarlayın) ve nicelleştirilebilir (kütle, konsantrasyon).
Kromatografi, laboratuvarlarda ve endüstride, çok bileşenli sistemlerin kalitatif ve kantitatif analizi, üretim kontrolü, özellikle birçok işlemin otomasyonu ile bağlantılı olarak ve ayrıca bireysel maddelerin (örneğin, değerli) hazırlayıcı (endüstriyel dahil) izolasyonu için yaygın olarak kullanılmaktadır. metaller), nadir ve dağınık elementlerin ayrılması.
Eluentin toplanma durumuna göre gaz (GC, GC) ve sıvı kromatografisi (HPLC, HPLC) ayırt edilir.
Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC, HPLC), sentetik polimerleri, ilaçları, deterjanları, proteinleri, hormonları ve diğer biyolojik olarak önemli bileşikleri analiz etmek, ayırmak ve saflaştırmak için kullanılır. Son derece hassas dedektörlerin kullanılması, biyolojik araştırmalarda son derece önemli olan çok az miktarda madde (10 -11 -10 -9 g) ile çalışmayı mümkün kılmaktadır.
HPLC yöntemi, çeşitli sıvı kromatograflar üzerinde gerçekleştirilir. Modern sıvı kromatograflar, karmaşık madde karışımlarını ayrı bileşenlere ayırmak ve ayrılan karışımın bileşenlerinin kalitatif ve kantitatif analizini yapmak için tasarlanmıştır.
yüksek performanslı sıvı kromatografi propifenazon
GMP'nin Rusya'da farmasötik üretim uygulamasına dahil edilmesiyle bağlantılı olarak. Modern birleşik analiz yöntemlerinin kullanılmasının önemi, hem üretim işletmelerinde hem de ilaçların kalitesinin devlet kontrolü sisteminde artmaktadır. İlaç endüstrisi gelişmiş ülkelerde (ABD, İngiltere, Japonya, AB ülkeleri) maddelerin ve bitmiş tıbbi ürünlerin kalitesini analiz etmenin temel yöntemi, yüksek performanslı sıvı kromatografisidir (HPLC). Bu yöntem, özelliklerine göre, ilaçların yaklaşık %80-90'ının kantitatif analiz gereksinimlerini karşılar.
Herhangi bir kromatografik tayini gerçekleştirme tekniği belirli koşullara tabidir. Genel Gereksinimler. Her şeyden önce, yeni başlayanlar arasında en çok soruya neden olanları not etmek gerekir.
1. Klima. Sıvı kromatografın kurulduğu odada keskin sıcaklık dalgalanmaları olmamalıdır.
Sıcaklıktaki değişiklikler tutma, verimlilik ve hatta ayırma seçiciliğinde değişikliklere yol açabilir.
Yaz sıcağında, koşulsuz odalarda normal fazlı hafif kaynayan mobil fazlar ile çalışmak çok zordur. Gün boyunca yavaş yavaş buharlaşırlar, bu da eluentin bileşiminde bir değişikliğe yol açar.
Daha düşük sıcaklıklarda, suyla zenginleştirilmiş ve/veya alkol içeren eluentlerle çalışırken sorunlar ortaya çıkar. Bu tür eluentlerin viskozitesi, azalan sıcaklıkla keskin bir şekilde artar, bu da sistemdeki basıncın artmasına neden olur.
Küçük sıcaklık dalgalanmalarının ayırma üzerindeki etkisi, kromatografik kolonun veya tüm sıvı sisteminin (tüm kromatograflar için mümkün olmayan) termostatlanmasıyla ortadan kaldırılabilir.
2. Güç kalitesi. Modern kromatografların çoğu güç stabilizasyon sistemleriyle donatılmıştır, ancak sahadaki güç kaynağının kalitesi de yüksek olmalıdır. Güç kaynağı yeterince iyi değilse, otomatik modda bir dizi tanımlamanın herhangi bir çalışması bir arıza nedeniyle başarısız olabilir.
3. Çözücülerin saflığı. Mobil fazların hazırlanması için yüksek saflıkta çözücüler kullanılmalıdır.
Genel olarak, mobil fazın saflığına ilişkin gereksinimler, saptama yöntemine, elüsyon yöntemine (izokratik veya gradyan), dedektörün hedef analite duyarlılığına ve konsantrasyonuna bağlıdır.
UV algılama kullanılırken, 230-240 nm'den daha az olan kısa dalga boyu aralığına geçişle birlikte solventlerin saflığı için gereksinimler artar. 220-240 nm'den daha büyük dalga boylarında UV algılamalı izokratik elüsyon için "yüksek saflık" dereceli solventler kullanılabilir. ve suyu damıtın. Mobil faza eklenen tüm reaktifler de yeterince saf olmalıdır; kullanımdan önce kristalli reaktifleri yeniden kristalleştirmek yararlıdır.
Gradyan elüsyonu, "sıvı kromatografisi için" dereceli solventler ve bidistilat su gerektirir. Gradyan elüsyon yöntemindeki (ters faz kromatografisinde) özel gereksinimler, özellikle sulu tamponun ve suyun saflığına yerleştirilir. Her şeyden önce, bunun nedeni, elüsyonun ilk aşamasında, adsorbanın, sulu bir tamponla zenginleştirilmiş mobil fazdan kirletici bileşenleri emmesi ve daha sonra elüe edilmesi ve kromatogramda "tümsekler" şeklinde görünmesidir. Yararlı analit sinyallerinin çıkarılmasını büyük ölçüde karmaşıklaştıran "eşikler" ve bireysel tepe noktaları.
En saf çözücüler, gradyan elüsyon modunda eser miktarlardaki maddelerin toplu tayinleri için gereklidir.
Gradyan elüsyon modunda belirlemelerin yanı sıra izokratik modda kesinlik belirlemeleri gerçekleştirmek için mobil faz bir kez uygulanmalıdır, yani elüat atılmalı veya atılmalıdır.
İzokratik elüsyon ile, belirli bir hassasiyet sorunu yoksa, harcanan eluent yeniden kullanılabilir. Detektörden geçtikten sonra elüatın mobil faz kabına geri döndürüldüğü bir sistem, bir "geri dönüşüm sistemi" olarak adlandırılır. Böyle bir sistem, yaklaşık 1 ml/dk'lık bir akış hızında standart sütunlar (250x4.6, 150x4.6) üzerinde çok sayıda rutin izokratik tayinler olması durumunda özellikle yararlıdır. Bu durumlarda geri dönüşüm sistemi günde 200-300 ml organik solvent tasarrufu sağlar. Bu ekonomik sistem, analiz için çok saf, pahalı solventlerin kullanımına izin verir. Pahalı çözücülerden tasarruf etme sorunu, mikro sütunların (80x2, 100x2) kullanılması durumunda daha az akuttur, çünkü ayırma, mobil fazın daha küçük hacmini gerektirir.
4. Çözücülerin gazdan arındırılması. Kromatografide hareketli fazlar hazırlamak için kullanılan çözücüler genellikle çözünmüş hava içerir. Özellikle havanın büyük bir kısmı su içerir.
Gazı giderilmemiş eluentler üzerinde çalışırken, hava kabarcıkları sıvı sisteminin çeşitli bileşenlerine girer: pompa, kolon, kapilerler, dedektör. Akışkan sistemine hava girdiğinde, akışkan sistemindeki basınç dalgalanmalarından kaynaklanan kromatogramda yüksek periyodik gürültüler görülür. Bu, analizin duyarlılığında keskin bir düşüşe yol açar.
Eluentlerinden havayı çıkarmak için gazı giderilir. Kural olarak, sulu-organik karışımlar önemli miktarlarda çözünmüş hava içerdiğinden, yalnızca ters faz ayrımları için eluentlerin gazı giderilir. Gradyan elüsyonu durumunda ve ayrıca florimetrik algılama kullanılırken özellikle dikkatli gaz giderme gerçekleştirilmelidir.
Ters faz modunda gradyan elüsyonu sırasında, iki eluent karıştırılır - çeşitli bileşimlerin su-organik karışımları. Gazı giderilmemiş eluentlerin karıştırılması, bir bütün olarak belirleme için kritik olan yoğun bir çözünmüş hava salınımına yol açar (hava kabarcıkları kromatogramda sıfır çizgisinde keskin "emisyonlar" olarak kaydedilir).
Florimetrik algılamanın hassasiyeti, mobil fazda yüksek miktarda çözünmüş hava içeriğinde azalır (floresan söndürülür). Bu nedenle, florimetrik algılama kullanılırken, eluentin gaz çıkışına özel dikkat gösterilmelidir.
Sıvı kromatografisi için mobil fazların gazını gidermenin üç ana yolu vardır.
a. Vakumla gaz giderme - eluent, birkaç dakika boyunca su jeti pompası vakumu altında bir Claisen şişesi içinde tutulur. Gaz giderme sırasında eluentin kaynatılmasından kaçınılmalıdır.
b. Termal gaz giderme, yüksek oranda su ile sulu-organik eluentleri gazdan arındırmak için kullanılır. Hareketli faz, hava geçirmez şekilde kapatılmayan bir şişeye yerleştirilir ve yaklaşık 50°C'lik bir su banyosunda bırakılır. 10-15 dakika sonra şişe bir tıpa ile kapatılır ve akan su altında oda sıcaklığına soğutulur.
içinde. Ultrason ile gaz giderme. Hareketli faz birkaç dakika sonikasyona tabi tutulur ve sonra 10-15 dakika yerleşmeye bırakılır. Bu yöntem genellikle su-organik eluentlerin gazının alınması için yeterince verimli değildir.
Sıvı kromatografisi için modern pompalama sistemleri, otomatik gaz giderme sistemleriyle donatılmıştır. Bununla birlikte, gradyan analizleri yapılırken, yukarıdaki yöntemlerden birine göre her iki mobil fazın da önceden ve "manuel" olarak gazının alınması daha iyidir.
5. Mobil fazın filtrelenmesi. Pompanın sorunsuz çalışmasını sağlamak için mobil fazın bir membran filtre kullanılarak vakum altında filtrelenmesi arzu edilir.
6. Kolon ve sıvı sistem bileşenlerinin yıkanması. Tuzlar ve asitler içeren sulu organik hareketli fazlar ile çalışıldıktan sonra tüm sıvı sistem (kolon dahil) %5-10 organik solvent ilavesi ile distile su ile yıkanmalıdır. Bu tür bir yıkama, çalışma saatleri dışında kromatografın sıvı sisteminin bileşenlerinin ve sabit fazın kendisinin ek olarak yıpranmaması için yapılır.
Bu tür bir yıkamanın yapılmaması, her şeyden önce, pompa durdurulduktan sonra, eluentten tuzların parçalarına ve dedektör küvetinin duvarlarına birikmesine yol açar. Bu da, bir bütün olarak cihazın dengesiz çalışmasına ve ayrıca pompanın hareketli parçalarının erken aşınmasına yol açar. Tuz ve asit içeren eluentler sisteminin düzenli olarak yıkanmaması, durağan fazın ömründe bir azalmaya yol açabilir.
Sıvı sisteminin biyolojik kontaminasyonunu önlemek için yıkama suyuna bir miktar organik solvent eklenmesi gereklidir.
7. Bir öncekiyle karışmayan yeni bir mobil aşamaya geçiş. Böyle bir geçiş, her iki hareketli faz ile de - genellikle izopropanol veya aseton yoluyla - sonsuz şekilde karışabilen bir ara çözücü vasıtasıyla gerçekleştirilir.
Sulu bir eluentten nonpolar bir eluent'e geçmek için sıvı sistem organik bir solvent ilave edilerek su ile yıkanmalı, ardından kromatografik kolon çıkarılmalı, sistem izopropanol (aseton) ile yıkanmalı, sistem temizlenmelidir. polar olmayan bir eluent ile yıkanmalı ve yeni bir kolon takılmalıdır.
Ters geçiş için kromatografik kolon çıkarılır, sıvı sistem izopropanol (aseton) ile, sonra sulu bir eluent ile yıkanır ve ardından yeni bir kolon kurulur.
Sulu bir eluentten polar olmayan bir eluent'e geçerken, pompa conta malzemesinin polar olmayan solventler için derecelendirildiğinden emin olun.
8. Numune filtrasyonu. Analiz edilen numune çözünmemiş bir süspansiyon içeriyorsa, numuneyi bir şırıngaya bağlı bir membran filtreden geçirerek filtrelemek istenir. Ne yazık ki, numune küçükse, bir mililitreden azsa, bu şekilde filtrelemek neredeyse imkansız hale gelir.
Askıda katı madde içeren numunelerin düzenli analizi ile kolon (frit) üzerindeki giriş filtresi tıkanabilir, bu da her şeyden önce sistemdeki basıncın artmasına neden olur. Bu durumda, giriş filtresini değiştirmek daha iyidir ve değiştirilmediyse, 10-15 dakika sonikasyon ile organik bir çözücüde yıkayın.
Soruna en uygun çözüm, kolondan önce bir hat içi filtre uygulamaktır. Sıralı filtre, sütundakiyle aynı, değiştirilebilir bir frit içerir. Bir sıralı filtredeki fritin değiştirilmesi, oldukça sık yapılabilen rutin bir işlemdir.
9. Koruma kolonlarının uygulanması. "Kirli" numunelerin düzenli analizi ile kromatografik kolon hızla kirlenir ve ayırma özelliğini kaybeder. Bu durumda kapsamlı numune hazırlamaya iyi bilinen bir alternatif, ana kolonu kontaminasyondan koruyan bir koruma kolonunun kullanılmasıdır.
Bazen numune hazırlamayı hiç yapmamak, ana kolondan önce hat içi filtre ve ön kolon koymak uygundur. Bu şemanın avantajları, daha az emek ve reaktif ile analizlerin basitliği ve hızıdır.
10. Kromatografik kolonların korunması. Yeterince uzun bir depolamadan önce, kromatografik kolonlar yıkanır ve her bir durağan faz tipi için oldukça spesifik bir solvent ile doldurulur.
Bu nedenle, normal fazlı sistemlerde çalışmaya yönelik kromatografik kolonlar, genellikle izooktan gibi yüksek kaynama noktalı hidrokarbonlarla doldurulur. Ters fazlar su ile yıkanır ve asetonitril ile veya düşük besleme hızında izopropanol ile doldurulur. Sulu tamponlarla çalıştırılması amaçlanan fazlar, az miktarda sodyum azit (bakteriostatik) ilavesiyle su ile doldurulur.
Sütun için saklama talimatları pasaportunda belirtilebilir.
11. Su tamponlarının depolanması. Rutin belirlemeler durumunda, mobil fazın bir kerede hazırlanması için büyük hacimli sulu tampon hazırlamak oldukça uygun olabilir. Ne yazık ki, bir bakteriyostatik olan sodyum azid eklenmedikçe sulu bir tampon birkaç günden fazla saklanamaz. Fosfat tamponuna dayalı mobil fazlar çok zayıf bir şekilde depolanır.
Bazen "tahlilin tekrarlanabilirliğini arttırmak" için büyük hacimli sulu tampon hazırlanır. Genel olarak konuşursak, bu yaklaşımla, analizin tekrarlanabilirliği artmaz, ancak arabellek depolama ile ilgili sorunlar kaçınılmaz görünmektedir.
Genel olarak, sorunun cevabı su tamponunu bir hafta mı yoksa bir gün için mi hazırlamalı? - sadece kolaylık ilkesi ile belirlenir.
12. Kalibrasyonun düzenliliği. Kural olarak, standart kalibrasyon her gün veya her yeni eluent hazırlandığında yapılır.
Kalibrasyon, kromatografik sistemin durağan durumuna ulaşıldığında gerçekleştirilir; okunabilir parametreler standart tepe noktasının alıkonma süresi, alanı (spektrofotometrik algılama durumunda - referans dalga boyunda), spektral oranlardır (bir tarama veya diyot matrisli spektrofotometrik dedektör kullanıldığında).
Çalışmanın başında, standart, tutma süresinin tekrarlanabilirliğini doğrulamak için iki kez analiz edilebilir.
1. HPLC ile "BICILLIN-3" preparasyonunun bileşenlerinin belirlenmesi
Bicillin-3 uzun etkili bir penisilindir ve benzilpenisilin (BP) sodyum, novokain ve benzatin tuzlarının bir karışımıdır. Mevcut VFS 42-3034-98'e göre, preparasyondaki BP'nin belirlenmesi HPLC kullanılarak gerçekleştirilir, novokain spektrofotometrik olarak belirlenir ve benzatin (N,N1-dibenziletilendiamin), sodyum klorür ile doyurulmuş sulu bir çözeltiden eter ile özütlenir. . Eterin buharlaştırılmasından sonra, benzatin, perklorik asit ile titrasyon yoluyla belirlenir.
Avrupa Farmakopesinde, BP'nin benzatin tuzundaki BP ve benzatin içeriği, pH 3.5'te bir sodyum fosfat çözeltisi ile bir metanol karışımı içinde gradyan HPLC kullanılarak belirlenir.
Bu çalışmanın amacı, bicillin-3'teki bileşenlerin belirlenmesi için izokratik modda bir HPLC yöntemi geliştirmektir.
deneysel kısım
AKO Sintez (Kurgan) tarafından üretilen Bicillin-3 kullanıldı. Çalışma, bir model 510 pompa, bir model 481 UV dedektörü ve bir model 7125 enjektörü (Rheodyne) ile 50 µl kapasiteli bir dozlama döngüsüne sahip bir Waters kromatografı (ABD) üzerinde gerçekleştirilmiştir. Tespit için, analiz edilen tüm bileşiklerin iyi tespit edildiği 214 nm'lik bir dalga boyu kullanıldı. Kromatogramların kaydı ve pik alanların ve ana tutma parametrelerinin hesaplanması, analogdan dijitale dönüştürücülü bir kişisel bilgisayar ve Multichrome programı kullanılarak gerçekleştirildi.
Bir ters fazlı HPLC yöntemi, Phenomenex'ten (ABD) 250 x 4.6 mm'lik bir Luna C18 (2) kolonu üzerinde çalışıldı, çünkü kolon, organik amin piklerinin veriminin geliştirilmiş simetrisi ile daha önce nispeten ucuz olduğunu kanıtlamıştı. Aynı amaçla, mobil faz olarak pH'ı 5.0 olan, bileşenlerden biri olarak trietilamin içeren bir tampon çözeltisi ile asetonitril karışımı kullanıldı.
Mobil fazın hazırlanması için ilk çözelti - trietilamin ile pH 5.0'a titre edilen 2.5 M fosforik asit çözeltisi. Stok solüsyon 10 kez su ile seyreltilerek bir HPLC tampon solüsyonu hazırlandı Elde edilen tampon solüsyonun 750 ml'si 250 ml asetonitril ile karıştırıldı. Aynı zamanda, mobil fazın görünen pH'ı 5.7'ye yükseldi. Mobil faz hızı 1 ml/dak. Kromatografi oda sıcaklığında yapıldı. Analiz süresi 20 dk.
İlacın bileşenleri asit-baz özelliklerinde farklılık gösterdiğinden - BP bir asittir ve novokain ve benzatin, pH'ta artış olan bazlardır, iyonlaşmalarının değiştiği pH aralığında tutma süreleri farklı yönlere kayar. Bu nedenle, pH'ı değiştirerek, analiz edilen bileşenlerin uygun bir şekilde tutulmasını seçmek kolaydır. Bununla birlikte, pH'daki bir artış, benzatin pikinin şeklinde gözle görülür bir bozulmaya yol açarken, bir azalma novokain ve BP hidroliz ürünlerinin yetersiz çözünürlüğüne yol açar. Yukarıdaki koşullar altında bicillin-3 bileşenlerinin ayrılması şekilde gösterilmiştir. Novokain, benzatin ve BP'nin alıkonma süreleri sırasıyla 4.2, 11.6 ve 14.8 dakika idi.
Önemli olan, BP hidrolizinin ürünleri olan 2 tepe arasındaki novokain zirvesinin çıktısıdır. Bu bağlamda, bileşenlerin daha iyi ayrılması için, mobil faza küçük miktarlarda 2.5 M fosforik asit veya trietilamin solüsyonlarının eklenmesi ve solüsyonu alınmış bir novokain ve BP karışımının kromatografisi ile ayrılmanın kontrol edilmesi önerilir. oda sıcaklığında yaklaşık bir gün saklandı.
Kantitatif belirleme için, 100 ml'lik bir ölçülü balona 20-25 mg bisilin-3 ilave edildi ve %20'lik sulu bir asetonitril çözeltisi içinde çözüldü. Çözünme için metanol veya çözeltilerinin kullanılması, BP'nin kısmi metilasyonuna yol açtı. Asetonitril konsantrasyonundaki bir artış, novokain zirvesinin genişlemesine yol açtı. Üst sınır Bir ilacın konsantrasyonu, çözünürlüğü ile sınırlıdır. BP ve benzatin için kalibrasyon grafikleri, uygun dönüştürmeden sonra BP'nin sodyum tuzu ve benzatin diasetat kullanılarak elde edildi. BP için kalibrasyon eğrisi 0,1-0,5 mg/ml bölgesinde, benzatin ve novokain için 0,01-0,05 mg/ml bölgesinde doğrusaldır. İlacın 5 serisindeki bileşenlerin belirlenmesinin sonuçları, her bir değerin 5 belirlemenin ortalaması olduğu tablo 1'de sunulmaktadır. Göreceli standart sapma, novokain için %1.6, benzatin için %3.4 ve BP için %1.4 idi.
Tablo 1'den, HPLC kullanılarak nicel belirleme sonuçlarının, ND tarafından düzenlenen izin verilen sınırlar içinde olduğu sonucu çıkmaktadır.
Önerilen yöntemin doğruluğunu teyit etmek için, bicillin-3'ün bileşenleri, BP'nin sodyum tuzu, benzatin diasetat ve novokainin karıştırılmasıyla hazırlanan model karışımlarda analiz edildi. Sonuçlar tablo.2'de gösterilmiştir. Sonuçlar orijinal bileşenlere göre yeniden hesaplanır.
Tablo 2'nin "Bulunan" sütunundaki her değer, 3 belirlemenin ortalama sonucudur. Ortalama nispi sapma, benzatin için %2.2, novokain için %0.9 ve BP için %0.8 idi; bu, gerçek numunelerdeki bileşenleri analiz ederken bulunan nispi ortalama standart sapmalarla ilişkilidir. Benzatin için, sonuçların dağılımı diğer bileşenlere göre biraz daha yüksektir, bu da düşük yükseklik ve düzensiz şekil tepe noktası ve buna bağlı olarak daha büyük bir entegrasyon hatası. ile ilgili diğer bir neden büyük hatalar benzatin tayininde, kuvvetli bir şekilde adsorbe edilmiş maddeler analiz edilirken bir enjektör hafıza etkisi meydana gelebilir. Bununla birlikte, HPLC yöntemini kullanan analizler için kabul edileni biraz aşan böyle bir saçılım bile benzatin tayini için oldukça kabul edilebilir.
sonuçlar
1. "Bicillin-3" preparasyonundaki bileşenlerin tespiti ve nicel tespiti için bir teknik geliştirilmiştir.
2. Teknik, ilacın birkaç serisi üzerinde test edilmiş ve bilinen bileşime sahip model karışımların analizi ile doğrulanmıştır.
2. Propifenazon içeren müstahzarların analizinde HPLC
Propifenazon (4-izopropil-2,3-dimetil-1-fenil-3-pirazolin-5-on; izopropilantipirin), pirazolon serisinin narkotik olmayan analjeziklerine aittir ve kombine reçetesiz satılan ilaçların bir parçasıdır. Şu anda, kafein tabletleri tıbbi uygulamada (bileşim: propifenazon-0.21 gr, parasetamol-0.25 gr, kafein-0.05 gr, kodein fosfat-0.01 gr) ve saridon (parasetamol-0.25 gr, propifenazon-0.15 gr, kafein-0.05) yaygın olarak kullanılmaktadır. g). Mevcut düzenleyici belgelere göre, kafein tabletlerinin gerçekliğini doğrulamak için ince bir sorbent tabakasındaki kromatografi kullanılır. Kantitatif belirlemenin, her bileşen için farklı yöntemler kullanılarak ilacın ayrı tartılmış kısımlarında gerçekleştirilmesi önerilmektedir: spektrofotometri, titrimetri, ince tabaka kromatografisi ve spektrofotometri kombinasyonu. Saridon, parasetamol, kafein ve propifenazon için düzenleyici belgelerde, bir Merck Lichrospher C18 sorbent ve bileşimin hareketli bir fazı ile 12,5 cm uzunluğunda sütunlarda HPLC ile belirlenir: metanol-0.01 M fosforik asit 30:70 oranında.
Bu çalışmanın amacı, HPLC kullanarak kafein ve saridon tabletlerinin bileşenlerini saptamak ve ölçmek için yöntemler geliştirmektir.
Alkaloid Skopje (Makedonya Cumhuriyeti) tarafından üretilen kafein tabletleri, Roche Nicholas S.A. Laboratories, Gaillard (Fransa) tarafından üretilen saridon ve bileşenlerinin maddelerini kullandık. Çalışma, sabit faz olarak ters fazlı bir sorbent Separon-C18 ile 8 cm uzunluğunda bir UV spektrofotometrik dedektörlü bir yerli mikrokolon sıvı kromatografı "Milichrom-4" üzerinde gerçekleştirildi. Analiz edilen bileşiklerin polar yapısı, su ve asetonitril içindeki iyi çözünürlükleri, hareketli faz olarak farklı oranlarda su-asetonitril karışımlarının seçilmesine yol açmıştır. Mobil fazlar asetonitril - su 9:1 oranlarında test edilmiştir; 7:3; 6:4; 8:2 ve asetonitril-su-dietilamin (3:2:0.2). Mobil fazın bileşiminin daha fazla kontrolünü engelleyen normal faz etkileşimlerini hariç tutmak için %80'den fazla bir organik çözücünün hacim fraksiyonuna sahip mobil fazların kullanımından kaçınıldı. %5'ten daha az bir çözücü hacim fraksiyonu, mobil fazın işlevsel kararsızlığına ve alıkonma sürelerinin yeniden üretilemezliğine yol açar. Mobil fazın bileşimine bir değiştirici olarak dietilaminin eklenmesi, kafein tabletlerinin 4 bileşeninin tamamının ayrılmasını mümkün kılmıştır. Oktadesil silika jelin yüzeyinde iyon değişimi etkileşimi yapabilen önemli miktarda artık silanol gruplarının olduğu bilinmektedir. Dietilamin, kromatografik işlemden silanol gruplarını ortadan kaldırır, tepe şeklini iyileştirir, analiz süresini azaltır ve silika jel yüzeyindeki pH'ı düzenler. Ölçüm aşağıdaki koşullar altında gerçekleştirilmiştir: kayıt ölçeği 2.0, alıkonma süresi 0.8 s, eluent akış hızı 50 µl/dk, numune enjeksiyon hacmi 3 µl. Pik tespiti 2 dalga boyunda - 238 ve 276 nm'de gerçekleştirildi.
Tanımlama, çalışılan maddelerin standart çözeltileri üzerinde önceden belirlenmiş olan alıkonma parametrelerine göre yapılmıştır.
Kafein tabletlerinin bileşenleri, bir asetonitril-su-dietilamin (3:2.2:0.2) mobil fazı kullanılarak ayrılır. Parasetamolün tutulma süresi 3.08 dakika, propifenazon - 5.73 dakika, kafein - 4.0 dakika, kodein - 4.67 dakika idi.
Saridon bileşenleri ayrıca bir asetonitril-su (8:2) hareketli fazı kullanılarak da ayrılabilir. Parasetamol için tutma süresi - 3.9 dk, propifenazon - 5.11 dk, kafein - 4.44 dk.
Miktar tayini için mutlak bir kalibrasyon yöntemi kullanıldı. Madde konsantrasyonunun doruk yüksekliğine doğrudan orantılı bir bağımlılığı, parasetamol için 50-200 μg / ml aralığında, propifenazon için - 25-128 μg / ml, kafein - 20-50 μg / ml, kodein - 59-234 μg / ml.
HPLC yönteminin karmaşık karışımların analizinde bazı sınırlamaları vardır. Karışımda makro ve mikro miktarlarda maddelerin eşzamanlı mevcudiyeti ile, ayırma kalitesini ve ortaya çıkan piklerin şeklini etkileyen kolon aşırı yükü meydana gelir. Kafeinde, parasetamol ve propifenazon ile ilgili olarak kodein fosfat içeriği 21-25 kat daha azdır, bu nedenle kodeini tablet bileşenlerinin geri kalanından ayırmak için sıvı ekstraksiyonu önerilir. Daha önce, parasetamol, propifenazon ve kafeinin, pH 2.0'da sulu çözeltilerden etil asetat ile sırasıyla %87.43, 87.29 ve %87.84 miktarında tek bir ekstraksiyonla ekstrakte edildiğini ve kodeinin tamamen sulu solüsyonda kaldığını ve ekstraksiyon için olduğunu bulduk. ve konsantrasyon pH 9.0-10.0'da kloroform kullanmak gereklidir.
Saridon ve kafein tabletlerinde parasetamol, propifenazon ve kafeinin kantitatif tayini için yöntem 20 tablet bir havanda ince homojen bir toz halinde öğütülür, ezilmiş tabletlerin tozunun yaklaşık 0.01 g'ı (doğru tartılır) tartılır ve içine yerleştirilir. 25 ml kapasiteli ölçülü balona 10 ml asetonitril eklenir ve iyice karıştırılır.
Şişenin içeriği asetonitril ile işarete kadar yapılmış, karıştırılmış ve süzülmüştür. Çözelti, 3.0 ul'lik bir hacimde kromatograf kolonuna enjekte edilir. Parasetamol, propifenazon ve kafein içeriği mutlak kalibrasyon yöntemi ile belirlenir. Belirlemenin sonuçları, elde edilen verilerin normatif belgelere (RD) göre içeriğin izin verilen sınırları içinde olduğu görülebildiği Tablo 1 ve 2'de gösterilmektedir.
Kafein tabletlerinde kodein fosfatın kantitatif tayini için yöntem. Yaklaşık 0,2 g ezilmiş tablet (doğru tartılmış) 20 ml su içinde çözülür, homojen bir çözelti elde edilene kadar iyice karıştırılır, ince ve çok ince tortular için bir filtreden süzülür, filtre 10 ml saf su ile yıkanır. Çözelti %10 sülfürik asit ile pH 2.0'a asitleştirilir. 10 ml'lik kısımlar halinde etil asetat ile üç kez ekstrakte edin. Ekstraktlar atılır. pH 9.0-10.0'a kadar sulu çözeltiye %25'lik bir amonyak çözeltisi eklenir. 10 ml'lik kısımlar halinde kloroform ile üç kez ekstrakte edildi. Birleştirilen kloroform özleri, porselen tabaklara yerleştirilir ve oda sıcaklığında buharlaştırılır. Kuru kalıntılar asetonitril içinde çözülür, 25 ml'lik bir ölçülü balona aktarılır ve aynı çözücü ile işarete kadar tamamlanır Elde edilen çözeltinin 3 ul'si bir kromatograf kolonuna enjekte edilir ve açıklanan koşullar altında kodein belirlenir. Tespitin sonuçları tablo.3'te gösterilmektedir.
Önerilen yöntemlerin doğruluğunu değerlendirmek ve sonuçların tekrarlanabilirliğini kontrol etmek için model karışımları hazırlanmış ve çalışılmıştır. Saridon tabletleri örneğine ilişkin veriler tablo.4'te verilmiştir. Tablo 4'ten görülebileceği gibi, bağıl belirleme hatası parasetamol için ±%1.19, propifenazon için ±%1.16 ve kafein için ±%1.63'ü geçmez.
Model karışımlarında saridon tabletlerinin bileşenlerinin nicel olarak belirlenmesi için yöntem. Parasetamol (yaklaşık 0.08 g), propifenazon (yaklaşık 0.05 g) ve kafeinin (yaklaşık 0.016 g) doğru ağırlıkları tartılır, 50 ml'lik bir ölçülü balona aktarılır, küçük bir hacimde asetonitril içinde çözülür ve aynı değerle işarete ayarlanır. çözücü. 2.5 ml'lik bir kısım alınır ve 25 ml'lik bir ölçülü balona aktarılır, hacim aynı çözücü ile işarete ayarlanır, karıştırılır ve süzülür. Çözelti, 3 µl'lik bir hacimde kromatograf kolonuna enjekte edilir.
sonuçlar
1. HPLC kullanılarak kafein ve saridon tabletlerinin bileşenlerinin saptanması için bir teknik geliştirilmiştir.
Parasetamol için alıkonma süresi 3.08 dakika, propifenazon için 5.73 dakika, kafein için 4 dakika ve kodein için 4.67 dakika idi.
2. Kafein ve saridon tabletlerinin bileşenlerinin kantitatif tayini için bir HPLC yöntemi önerildi.
Göreceli belirleme hatası parasetamol için ±1.19-1.21, propifenazon için ±1.16-1.71, kafein için ±1.22-1.63 ve kodein için ±%2.95 idi.
3. "Adanol" ilacının standardizasyonu
İlaç şirketi "Polisan", "Cytoflavin" (enjeksiyonlar, tabletler) ve "Adanol" dahil olmak üzere beynin metabolik süreçlerini uyaran bir dizi karmaşık metabolik ilaç geliştirdi. "Adanol", antihipoksik ve anti-iskemik özelliklere sahiptir ve umut vericidir. ilaç felç sonuçları olan hastaların tedavisi için. Enterik bir kaplama ile kaplanmış bir tablet dozaj formudur.
Süksinik asit (YA), pirasetam (Pc), riboksin (Rb), nikotinamid (NA), piridoksin hidroklorür (PG), riboflavin mononükleotitten (RF) oluşur.
Çalışmanın amacı, "Adanol" ilacı örneğini kullanarak karmaşık çok bileşenli karışımlarda UC'nin kalitatif ve kantitatif tayini için bir yöntem geliştirmektir.
Shimadzu'dan (Japonya) bir UV dedektörü ve Supelco Inc.'den bir Hypersil BDS C18 kolonu ile yüksek basınçlı bir sıvı kromatografı kullandık. tane boyutu 5 µm, uzunluk 250 mm, iç çap 4.6 mm. Mobil faz, bir fosfat tamponuna (pH 2.6-7.0) dayanan bir su-organik fazdır. Algılama dalga boyu 206 nm'dir. Analiz modu izokratik, elüsyon hızı 500 µl/dak; numune hacmi 20 µl. UV spektrumları, bir Shimadzu UV mini-1240 spektrofotometrede kaydedildi.
İlacı oluşturan maddelerin çoğunun kantitatif tayini için spektrofotometrik analiz yöntemleri önerilmiştir. Bununla birlikte, preparasyonun bileşenlerinin spektral özelliklerinin bir karşılaştırması, UV bölgesindeki YA, PG, NA, Pb ve Pc'nin absorpsiyon bölgelerinin birbiriyle örtüştüğünü göstermiştir (Şekil 1).
Bu bakımdan karışımdaki içerikleri doğrudan spektrofotometri ile belirlenemez ve bu durumda HPLC yönteminin kullanılması tavsiye edilir. Sadece RF, 350 nm'den (lmax=373, E1% 1cm=202 ve lmax=445 nm, E1% 1cm=243) fazla spesifik absorpsiyon bölgesine sahiptir, bu nedenle, bunun için spektrofotometrik yöntemle kalitatif ve kantitatif bir analiz önerilmektedir. .
Elde edilen verilere dayanarak, lopt = 206 nm olan 5 maddenin analizi için optimal çalışma dalga boyu seçildi (bakınız Şekil 1). Bu değer, karışımın diğer bileşenlerine kıyasla en düşük spesifik absorpsiyona (λmax=206 nm E1% 1cm=5.8) sahip olan UC'nin UV spektrumunun maksimum değeridir (tabloya bakınız).
Preparata dahil edilen tüm maddeler iyonojenik olduğundan, polar olmayan sabit ve polar hareketli fazlar kullanılarak yapılan analizler için ters fazlı kromatografi kullanılması tavsiye edilir. İyonik bileşiklerin ters fazlı kromatografisinde, pH değeri, tek tek maddelerin ayrılma verimliliğini önemli ölçüde etkileyen faktörlerden biridir. Modern ters fazlı sorbentlerle çalışırken, genellikle mobil fazın bir parçası olarak 2,0 ila 8,0 pH tampon çözeltileri kullanılır. Seçilen optimum çalışma dalga boyu 206 nm olduğundan, 200 nm'nin üzerindeki UV dalga boyu aralığında hiçbir konumu olmadığı için bir fosfat tamponu kullanmak en iyisidir.
YaC'nin davranışını incelemek için farklı değerler pH spektrumları, pH 7.0 ve 2.6 (Şekil 2) fosfat tampon çözeltilerinde alınmıştır. pH 2.6'da, UC'nin moleküler formunun hipokromik bir etkisi gözlenir - absorpsiyon, pH 7.0'daki spektrumla karşılaştırıldığında 3 kat azalır (bu pH değerinde, UC'nin ayrışması tamamen bastırılır). Bunu akılda tutarak, mobil fazın optimal pH değeri 7.0'dır. Ayrıca, mobil fazın bileşiminin ve pH'ının ilaç bileşenlerinin ayrılma verimliliği üzerindeki etkisi incelenmiştir. pH 2.6'da, karışım ayrı ayrı tepelere tamamen ayrılmadı - Pc, Na ve PG ayrılmıyor ve ilk bir tepe olarak çıkıyor, ardından ayrı ayrı tepeler şeklinde YaK ve Pb geliyor. pH 5.5'te bileşenlerin tam olarak ayrılması da söz konusu olmamıştır. pH 7.0'da, karışımın bileşenlerinin tamamen ayrılması olmuştur. Tüm maddeler, aşağıdaki sırayla bireysel pikler olarak ortaya çıktı: YA, Pc, PG, NA ve Pb. Ancak ayırma işlemi uzundur - 45-50 dakika.
Mobil fazın daha büyük bir ayrıştırma gücü sağlamak ve ayırma işlemini hızlandırmak için, bileşimine daha az polar bir organik çözücü eklemek gerekir. HPLC'de ayrıştırıcı ajanlar olarak en yaygın olarak kullanılan solventlerden, şeffaflık limitleri sırasıyla 195 ve 205 nm olan, seçilen çalışma dalga boyunda (lopt = 206 nm) UV ışığında şeffaflık sınırı açısından asetonitril ve metanol kullanabiliriz.
Mobil fazın bileşimine %2 metanolün eklenmesi işlem süresini azalttı, ancak HA zirvesi yüksek bir asimetriye sahipti ve Pb zirvesi, HA zirvesinin kuyruğuna bindirildi. Metanol konsantrasyonu %1'e düşürüldükten sonra, Pb ve HA pikleri örtüşmedi, ancak HA pikinin asimetrisi arttı. Bunu azaltmak için, %1 metanol içeren mobil faza asetonitril eklendi.
Deneyler sonucunda, bir mobil faz seçildi - %5 metanol ve %0.5 asetonitril içeren bir fosfat tamponu pH 7.0'dan oluşan ve 5 bileşenin tümünün etkin bir şekilde ayrılmasını sağlayan sulu-organik bir faz (Şekil 3). Bu sistemdeki toplam kromatografi süresi 35 dakikaydı ve bileşenlerin alıkonma süreleri yaklaşık (dakika olarak) idi: YaK için 5.3, Pc için 15, PG için 19.3, NA için 26 ve Pb için 31.
Kantitatif belirleme, tek tek bileşenlerin standart örneklerinin çözeltileri kullanılarak harici standart yöntemle gerçekleştirildi.
Önerilen nicel belirleme yönteminin metrolojik özellikleri, 5 tekrarlamalı model karışımları üzerinde çalışılmış ve tabloda sunulmuştur.
Tablodan aşağıdaki gibi, "Adanol" preparasyonunda geliştirilen yöntemi kullanarak, 5 bileşenin tümünü, %3'ten fazla olmayan bir bağıl hata ile belirlemek mümkündür. güven seviyesi 95%.
İlacın ana bileşenlerinin piklerine ek olarak, yukarıdaki koşullar altında elde edilen kromatogram, sırasıyla Pb ve NA'dan hidroliz sırasında oluşanların yanı sıra, başlangıç maddelerinde bulunan hipoksantin ve nikotinik asit piklerini tanımlamıştır. Böylece geliştirilen teknik, müstahzardaki bu yabancı safsızlıkların niteliksel ve niceliksel olarak belirlenmesini mümkün kılmaktadır.
sonuçlar
1. Çok bileşenli bir karışımda HPLC yöntemi kullanılarak süksinik asidin kantitatif analizi için optimal koşullar belirlendi.
2. Safsızlıklar da dahil olmak üzere "Adanol" ilacının bileşenlerinin kalitatif ve kantitatif analizi için, %3'ten fazla olmayan nispi bir belirleme hatasıyla bir teknik geliştirilmiştir.
kullanılmış literatür listesi
1. MA Kazmin, A.V. Mikhalev, A.P. Arzamastsev "HPLC ile "BICILLIN-3" preparasyonunun bileşenlerinin belirlenmesi" // Eczacılık - No. 5 - 2002 - s.5-6.
2. T.Kh. Vergeichik, N.S. Onegov "propifenazon içeren müstahzarların analizinde HPLC" // Eczacılık - No. 6 - 2002 - s.13-16.
3. A.Yu. Petrov, S.A. Dmitrichenko, A.L. Kovalenko, L.E. Alekseeva ""Adanol" ilacının standardizasyonu // Eczane - No. 5 - 2002 - s.11-13.
Ek olarak
1. Baram G.I., Fedorova G.A. // Kromatografinin gıda, mikrobiyoloji ve tıp endüstrilerinde uygulanması: Mat. Vs. Konf. - Gelendzhik, 1990 - S.43-44.
2. Krichkovskaya L.V., Chernenkaya L.A. // Kromatografinin gıda, mikrobiyoloji ve tıp endüstrilerinde uygulanması: Mat. Vs. Konf. - Gelendzhik, 8-12 Ekim 1990, M., 1990. - S.49.
3. Kromatografi: Yöntemin pratik uygulaması: 2 kısım. Bölüm 2 - M.: Mir, 1986. - 422 s.