Скільки потрібно хроматограм для застосування методики ВЕРХ. Курсова робота: Високоефективна рідинна хроматографія забруднювачів природних та стічних вод
«Високоефективна рідинна хроматографія природних забруднювачів і стічних вод»
Вступ
Глава 1. Основні поняття та класифікація методів рідинної хроматографії
1.1 Апаратура для рідинної хроматографії
Глава 2. Сутність ВЕРХ
2.1 Застосування
Глава 3. Приклади використання ВЕРХ в аналізі об'єктів довкілля
Глава 4. Апаратура для ВЕРХ
Література
додаток
Вступ
Хроматографічні методичасто виявляються незамінними для ідентифікації та кількісного визначення органічних речовиніз подібною структурою. При цьому найбільш широко використовуються для рутинних аналізів забруднювачів довкілля є газова та високоефективна рідинна хроматографія. Газохроматографічний аналіз органічних забруднювачів у питній та стічних водах спочатку ґрунтувався на використанні насадочних колонок, пізніше поширення набули і кварцові капілярні колонки. Внутрішній діаметр капілярних колонок зазвичай становить 0,20-0,75 мм, довжина - 30-105 м. Оптимальні результати при аналізі забруднювачів у воді досягаються найчастіше при використанні капілярних колонок з різною товщиною плівки з метилфенілсиліконів з вмістом фенільних груп 5 і 50% . Вразливим місцем хроматографічних методик із використанням капілярних колонок часто стає система введення проби. Системи введення проби можна поділити на дві групи: універсальні та селективні. До універсальних відносяться системи введення з розподілом і без поділу потоку, "холодне" введення в колонку та випаровування при програмуванні температури. При селективному введенні використовують продування з проміжним уловлюванням у пастці, парофазний аналіз тощо. При використанні універсальних систем введення колонку надходить вся проба повністю, при селективної інжекції вводиться лише певна фракція. Результати, одержувані при селективному введенні, є більш точними, оскільки фракція, що потрапила в колонку, містить тільки леткі речовини, і техніка при цьому може бути повністю автоматизована.
Газохроматографічні детектори, що використовуються в моніторингу забруднювачів, часто поділяють на універсальні, що відгукуються на кожен компонент у рухомій фазі, і селективні, що реагують на присутність у рухомій фазі певної групи речовин зі подібними хімічними характеристиками. До універсальних відносяться полум'яно-іонізаційний, атомно-емісійний, мас-спектрометричний детектори та інфрачервона спектрометрія. Селективними детекторами, що використовуються в аналізі води, є електронно-захоплювальний (селективний до речовин, що містить атоми галогенів), термоіонний (селективний до азот- і фосфоровмісних сполук), фотоіонізаційний (селективний до ароматичних вуглеводнів), детектор з електролітичної провідності містить атоми галогенів, сірки та азоту). Мінімально детектується кількість речовин - від нанограмів до пікограмів в секунду.
Високоефективна рідинна хроматографія(ВЕРХ) є ідеальним методом для визначення великої кількостітермічно нестійких сполук, які не можуть бути проаналізовані газовою хроматографією. Об'єктами аналізу методом рідинної хроматографії в даний час часто стають сучасні агрохімікати, до яких входять метилкарбонати та фосфорорганічні інсектициди, інші нелеткі речовини. Високоефективна рідинна хроматографія набуває все більшого поширення серед інших методів, що застосовуються в моніторингу навколишнього середовища, ще й тому, що має блискучі перспективи щодо автоматизації пробопідготовки.
РОЗДІЛ 1. ОСНОВНІ ПОНЯТТЯ І КЛАСИФІКАЦІЯ МЕТОДІВ РІДИНОЇ ХРОМАТОГРАФІЇ
Рідинну хроматографію поділяють кілька класів залежно від типу носія нерухомої фази. Просте апаратурне оформлення паперової та тонкошарової хроматографій зумовили широке використання цих методів у аналітичній практиці. Однак великі можливості колонкової рідинної хроматографії стимулювали вдосконалення обладнання для цього класичного методу і призвели до швидкого впровадження ВЕРХ. Пропускання елюентів через колонку під високим тиском дозволило різко збільшити швидкість аналізу та суттєво підвищити ефективність поділу за рахунок використання дрібнодисперсного сорбенту. Метод ВЕРХ в даний час дозволяє виділяти, кількісно та якісно аналізувати складні суміші органічних сполук.
За механізмом взаємодії речовини, що розділяється (елюату) з нерухомою фазою розрізняють адсорбційну, розподільну, іонообмінну, екслюзійну, іон-парну, лігандообмінну і афінну хроматографії.
Адсорбційна хроматографія. Поділ методом адсорбційної хроматографії здійснюється в результаті взаємодії речовини, що розділяється з адсорбентом, таким як оксид алюмінію або силікагель, що мають на поверхні активні полярні центри. Розчинник (елюенти) - неполярна рідина. Механізм сорбції полягає у специфічній взаємодії між полярною поверхнею сорбенту та полярними (або здатними поляризуватися) ділянками молекул аналізованого компонента (рис. 1).
Рис. 1. Адсорбційна рідинна хроматографія.
Розподільча хроматографія. При розподільчому варіанті рідинної хроматографії поділ суміші речовин здійснюється за рахунок відмінності їх коефіцієнтів розподілу між двома фазами, що не змішуються, - елюентом (рухомою фазою) і фазою, що знаходиться на сорбенті (нерухома фаза).
При нормально-фазовимваріанті розподільної рідинної хроматографії використовуються неполярний елюенти та полярні групи, щеплені до поверхні сорбенту (найчастіше силікагелю). Як модифікатори поверхні силікагелю (щеплених фаз) використовуються заміщені алкілхлорсилани, що містять полярні групи, такі як нітрильна, аміногрупа і т. д. (рис. 2). Застосування щеплених фаз дозволяє тонко керувати сорбційними властивостями поверхні нерухомої фази і досягати високої ефективності поділу.
Рис. 2. Розподільна хроматографія з щепленою фазою (нормально-фазний варіант).
Обернено-фазоварідинна хроматографія заснована на розподілі компонентів суміші між полярним елюентом та неполярними групами (довгими алкільними ланцюжками), щепленими до поверхні сорбенту (рис. 3).
Рис. 3. Розподільна хроматографія з щепленою фазою (навернено-фазний варіант).
Менш широко використовують варіант рідинної хроматографії з нанесеними фазами, коли рідка нерухома фаза наноситься на нерухомий носій.
Ексклюзивна (гельпроникна)хроматографія є варіант рідинної хроматографії, в якому поділ речовин відбувається за рахунок розподілу молекул між розчинником, що знаходиться в порах сорбенту і розчинником, що протікає між його частинками.
Афіннахроматографія заснована на специфічних взаємодіях білків (антитіл), що розділяються, з щепленими на поверхні сорбенту (синтетичної смоли) речовинами (антигенів), вибірково утворюючими з білками комплекси (коньюгати).
Іонообмінна, іон-парна, лігандообмінна хроматографії застосовуються в основному в неорганічному аналізі.
Основні параметри хроматографічного поділу.
Основними параметрами хроматографічного поділу є об'єм, що утримується, і час утримування компонента суміші (рис. 4).
Час утримування tR - це час, що минув від моменту введення проби в колонку до виходу максимуму піку. Помноживши час утримування на об'ємну швидкість елюентів F ,отримаємо об'єм VR, що утримується:
Виправлений час утримання - час, що минув з моменту появи максимуму піку несорбируемого компонента до піку відповідної сполуки:
tR" = tR - t0 ;
Наведений або виправлений об'єм утримування - це об'єм утримування з поправкою на мертвий об'єм колонки V0, тобто на об'єм утримування компонента, що не сорбується:
VR" = VR - V0;
Характеристикою утримування є також коефіцієнт ємності k", який визначається як відношення маси речовини в нерухомій фазі до маси речовини в рухомій фазі: k" = mн / mп;
Величину k" легко визначити за хроматограмою:
Найважливішими параметрами хроматографічного поділу є його ефективність та селективність.
Ефективність колонки, що вимірюється висотою теоретичних тарілок (ВЕТТ) і обернено пропорційна їх числу (N) тим вище, ніж пік речовини, що виходить при тому ж часу утримування. Значення ефективності може бути обчислено за хроматограмою за такою формулою:
N = 5.54. (tR / 1/2) 2 ,
де tR- час утримування,
w 1/2 - Ширина піка на половині висоти
Знаючи число теоретичних тарілок, що припадає на колонку, довжину колонки L і середній діаметр зерна сорбенту dc, легко отримати значення висоти, еквівалентної теоретичної тарілці (ВЕТТ) та наведеної висоти (ПВЕТТ):
ВЕТТ = L/N ПВЕТТ = ВЕТТ/d c
Ці характеристики дозволяють порівнювати ефективність колонок різних типів, оцінювати якість сорбенту і якість заповнення колонок.
Селективність поділу двох речовин визначається за рівнянням:
При розгляді поділу суміші двох компонентів важливим параметром є також ступінь поділуRS:
;
Піки вважаються дозволеними, якщо величина RS більша або дорівнює 1.5.
Основні хроматографічні параметри пов'язують наступне рівняння для вирішення:
;
Чинниками, що визначають селективність поділу, є:
1) хімічна природа сорбенту;
2) склад розчинника та його модифікаторів;
3) хімічна структура і властивості компонентів суміші, що розділяється;
4) температура колонки
1.1 Апаратура для рідинної хроматографії
У сучасній рідинній хроматографії використовують прилади різного ступеня складності - від найпростіших систем до хроматографів високого класу, забезпечених різними додатковими пристроями.
На рис. 4. представлена блок-схема рідинного хроматографа, що містить мінімально необхідний набір складових частин, у тому чи іншому вигляді, присутніх у будь-якій хроматографічній системі.
Рис. 4. Блок-схема рідинного хроматографа.
Насос (2) призначений створення постійного потоку розчинника. Його конструкція визначається, перш за все, робочим тиском у системі. Для роботи в діапазоні 10-500 МПа використовуються насоси плунжерного (шприцевого) або пістонного типів. Недоліком перших є необхідність періодичних зупинок для заповнення елюентом, а других – велика складність конструкції та, як наслідок, висока ціна. Для простих систем з невисокими робочими тисками 1-5 МПа з успіхом застосовують недорогі перистальтичні насоси, але так як при цьому важко досягти сталості тиску та швидкості потоку, їх використання обмежене препаративними завданнями.
Інжектор (3) забезпечує введення проби суміші компонентів, що розділяються в колонку з досить високою відтворюваністю. Прості системи введення проби - "stop-flow" вимагають зупинки насоса і тому менш зручні, ніж петлеві дозатори, розроблені фірмою Reodyne.
Колонки (4) для ВЕРХ є товстостінні трубки з нержавіючої сталі, здатні витримати високий тиск. Велику роль відіграє щільність та рівномірність набивання колонки сорбентом. Для рідинної хроматографії низького тиску успішно використовують товстостінні скляні колонки. Постійність температури забезпечується термостатом (5).
Детектори (6) для рідинної хроматографії мають проточну кювету, в якій відбувається безперервне вимірювання будь-якої властивості елюенту, що протікає. Найбільш популярними типами детекторів загального призначення є рефрактометри, що вимірюють показник заломлення, та спектрофотометричні детектори, що визначають оптичну щільність розчинника на фіксованій довжині хвилі (як правило, в ультрафіолетовій області). До переваг рефрактометрів (і недоліків спектрофотометрів) слід віднести низьку чутливість до типу об'єднаної сполуки, яка може і не містити хромофорних груп. З іншого боку, застосування рефрактометрів обмежено ізократичними системами (з постійним складом елюентів), так що використання градієнта розчинників у цьому випадку неможливе.
Колонки для ВЕРХ, які найчастіше використовують у аналізах забруднювачів довкілля, мають довжину 25 див і внутрішній діаметр 4,6 мм, заповнюються вони сферичними частками силікагелю розміром 5-10 мкм з щепленими октадецильными групами. У Останніми рокамиз'явилися колонки з меншим внутрішнім діаметром, заповненими частинками меншого розміру. Використання таких колонок призводить до зменшення витрати розчинників та тривалості аналізу, збільшення чутливості та ефективності поділу, а також полегшує проблему підключення колонок до спектральних детекторів. Колонки з внутрішнім діаметром 3,1 мм забезпечують запобіжним картриджем (форколонкою) для збільшення терміну служби та покращення відтворюваності аналізів.
Як детектори в сучасних приладах для ВЕРХ використовуються зазвичай УФ-детектор на діодній матриці, флуоресцентний та електрохімічний.
Слід пам'ятати, що у практичній роботі поділ часто протікає по одному, а, по декількома механізмами одночасно. Так, екслюзійний поділ буває ускладнений адсорбційними ефектами, адсорбційний - розподільчими, і навпаки. При цьому чим більша відмінність речовин у пробі за ступенем іонізації, основності або кислотності, за молекулярною масою, поляризацією та іншими параметрами, тим більша ймовірність прояву іншого механізму поділу для таких речовин.
На практиці, найбільшого поширення набула «наверненофазова» (розподільна) хроматографія, в якій нерухома фаза не полярна, а рухлива полярна (тобто зворотна «прямофазної» хроматографії).
У більшості лабораторій світу групу із 16 пріоритетних ПАУ аналізують методами ВЕРХ чи ХМС.
ГЛАВА 2. СУТНІСТЬ ВЕРХ
У високоефективній рідинній хроматографії (ВЕРХ) характер процесів, що відбуваються в хроматографічній колонці, загалом ідентичний з процесами в газовій хроматографії. Відмінність полягає лише у застосуванні як нерухомої фази рідини. У зв'язку з високою щільністю рідких рухомих фаз і великим опором колонок газова та рідинна хроматографія сильно розрізняються за апаратурним оформленням.
У ВЕРХ як рухомі фази зазвичай використовують чисті розчинники або їх суміші.
Для створення потоку чистого розчинника (або сумішей розчинників), званого рідинної хроматографії елюентом, використовуються насоси, що входять в гідравлічну систему хроматографа.
Адсорбційна хроматографія здійснюється внаслідок взаємодії речовини з адсорбентами, такими як силікагель або оксид алюмінію, що мають на поверхні активні центри. Різниця у здатності до взаємодії з адсорбційними центрами різних молекул проби призводить до їхнього поділу на зони в процесі руху з рухомою фазою по колонці. Досяжний при цьому поділ зон компонентів залежить від взаємодії як з розчинником, так і з адсорбентом.
Найбільше застосування у ВЕРХ знаходять адсорбенти із силікагелю з різним об'ємом, поверхнею та діаметром пор. Значно рідше використовують оксид алюмінію та інші адсорбенти. Основна причина цього:
Недостатня механічна міцність, що не дозволяє упаковувати та використовувати при підвищених тисках, характерних для ВЕРХ;
силікагель порівняно з оксидом алюмінію має ширший діапазон пористості, поверхні та діаметру пор; Значно більша каталітична активність оксиду алюмінію призводить до спотворення результатів аналізу внаслідок розкладання компонентів проби або їхньої незворотної хемосорбції.
Детектори для ВЕРХ
Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) використовується для детектування полярних нелетючих речовин, які з будь-яких причин не можуть бути переведені у зручну форму для газової хроматографії, навіть у вигляді похідних. До таких речовин, зокрема, відносять сульфонові кислоти, водорозчинні барвники та деякі пестициди, наприклад, похідні феніл - сечовини.
Детектори:
УФ – детектор на діодній матриці. «Матриця» фотодіодів (їх більше двохсот) постійно реєструє сигнали в УФ і видимій області спектру, забезпечуючи таким чином запис УФ-В-спектрів в режимі сканування. Це дозволяє безперервно знімати при високій чутливості неспотворені спектри компонентів, що швидко проходять через спеціальну комірку.
У порівнянні з детектуванням на одній довжині хвилі, яке не дає інформації про «чистоту» піку, можливості порівняння повних спектрів діодної матриці забезпечують отримання результату ідентифікації з більшим ступенем достовірності.
Флуоресцентний детектор. Велика популярність флуоресцентних детекторів пояснюється дуже високою селективністю і чутливістю, і тим, що багато забруднювачів довкілля флуоресцируют (наприклад, поліароматичні вуглеводні).
Електрохімічний детектор використовуються для детектування речовин, які легко окислюються або відновлюються: феноли, меркаптани, аміни, ароматичні нітро- та галогенпохідні, кетони альдегіди, бензидини.
Хроматографічне поділ суміші на колонці внаслідок повільного просування ПФ займає багато часу. Для прискорення процесу хроматографування проводять під тиском. Цей метод називають високоефективною рідинною хроматографією (ВЖХ)
Модернізація апаратури, що застосовується в класичній рідинної колонкової хроматографії, зробила її одним з перспективних і сучасних методів аналізу. Високоефективна рідинна хроматографія є зручним способом поділу, препаративного виділення і проведення якісного і кількісного аналізу нелетких термолабільних сполук як з малою, так з великою молекулярною масою.
Залежно від типу сорбенту в даному методі використовують 2 варіанти хроматографування: на полярному сорбенті з використанням неполярного елюенту (варіант прямої фази) і на неполярному сорбенті з використанням полярного елюенту - так звана звернено-фазова високоефективна рідинна хроматографія (ОфВЖХ).
При переході елюентів до елюентів рівновага в умовах ОфВЖХ встановлюється набагато швидше, ніж в умовах полярних сорбентів і неводних ПФ. Внаслідок цього, а також зручності роботи з водними та водно-спиртовими елюентами, ОфВЖХ набула нині великої популярності. Більшість аналізів за допомогою ВЖХ проводять саме цим методом.
детектори. Реєстрація виходу з колонки окремого компонента провадиться за допомогою детектора. Для реєстрації можна використовувати зміну будь-якого аналітичного сигналу, що йде від рухомої фази та пов'язаного з природою та кількістю компонента суміші. У рідинній хроматографії використовують такі аналітичні сигнали, як світлопоглинання або світловиділення вихідного розчину (фотометричні та флуориметричні детектори), показник заломлення (рефрактометричні детектори), потенціал та електрична провідність (електрохімічні детектори) та ін.
Безперервно детектований сигнал реєструється самописцем. Хроматограма являє собою зафіксовану на стрічці самописця послідовність сигналів детектора, що виробляються при виході з колонки окремих компонентів суміші. У разі поділу суміші на зовнішній хроматограмі видно окремі піки. Положення піку на хроматограмі використовують для ідентифікації речовини, висоту або площу піку - для цілей кількісного визначення.
2.1 Застосування
Найбільш широке застосування ВЕРХ знаходить у наступних областях хімічного аналізу (виділено об'єкти аналізу, де ВЕРХ практично не має конкуренції):
· Контроль якості продуктів харчування - тонізуючі та смакові добавки, альдегіди, кетони, вітаміни, цукру, барвники, консерванти, гормональні препарати, антибіотики, тріазинові, карбаматні та ін пестициди, мікотоксини, нітрозоаміни, поліциклічні ароматичні вуглеводні і т.п.
· Охорона навколишнього середовища - феноли, органічні нітросполуки, моно-і поліциклічні ароматичні вуглеводні, ряд пестицидів, головні аніони та катіони.
· Криміналістика – наркотики, органічні вибухові речовини та барвники, сильнодіючі фармацевтичні препарати.
· Фармацевтична промисловість – стероїдні гормони, практично всі продукти органічного синтезу, антибіотики, полімерні препарати, вітаміни, білкові препарати.
· Медицина - перелічені біохімічні та лікарські речовини та їх метаболіти в біологічних рідинах (амінокислоти, пурини та піримідини, стероїдні гормони, ліпіди) при діагностиці захворювань, визначенні швидкості виведення лікарських препаратів з організму з метою їх індивідуального дозування.
· Сільське господарство- визначення нітрату та фосфату в ґрунтах для визначення необхідної кількості внесених добрив, визначення поживної цінності кормів (амінокислоти та вітаміни), аналіз пестицидів у ґрунті, воді та сільгосппродукції.
· Біохімія, біоорганічна хімія, генна інженерія, біотехнологія - цукру, ліпіди, стероїди, білки, амінокислоти, нуклеозиди та їх похідні, вітаміни, пептиди, олігонуклеотиди, порфірини та ін.
· органічна хімія - всі стійкі продукти органічного синтезу, барвники, термолабільні сполуки, нелеткі сполуки; неорганічна хімія (практично всі розчинні сполуки у вигляді іонів та комплексних сполук).
· Контроль якості та безпеки продуктів харчування, алкогольних та безалкогольних напоїв, питної води, засобів побутової хімії, парфумерії на всіх стадіях їх виробництва;
· Визначення характеру забруднень на місці техногенної катастрофи або надзвичайної події;
· Виявлення та аналіз наркотичних, сильнодіючих, отруйних та вибухових речовин;
· Визначення наявності шкідливих речовин(поліциклічні та інші ароматичні вуглеводні, феноли, пестициди, органічні барвники, іони важких, лужних та лужноземельних металів) у рідких стоках, повітряних викидах та твердих відходах підприємств та в живих організмах;
· моніторинг процесів органічного синтезу, нафто- та вуглепереробки, біохімічних та мікробіологічних виробництв;
аналіз якості ґрунтів для внесення добрив, наявності пестицидів та гербіцидів у ґрунті, воді та в продукції, а також поживній цінності кормів; складні дослідні аналітичні завдання; одержання мікрокількості надчистої речовини.
ГЛАВА 3. ПРИКЛАДИ ВИКОРИСТАННЯ ВЕРХ В АНАЛІЗІ ОБ'ЄКТІВ НАВКОЛИШНЬОГО СЕРЕДОВИЩА
ВЕРХ – метод моніторингу ПАУ в об'єктах навколишнього середовища
Для поліциклічних ароматичних вуглеводнів (ПАУ), екотоксикантів 1-го класу небезпеки, встановлені вкрай низькі рівні гранично допустимих концентрацій (ГДК) природні об'єкти. Визначення ПАУ на рівні ГДК і нижче відноситься до дуже складних аналітичних завдань і для їх вирішення застосовуються високотехнологічні методи аналізу (ГХ-МС, ГХ, ВЕРХ). При виборі способу для моніторингу до основним аналізованим параметрам – чутливість і селективність, додаються експресність і економічність, т.к. моніторинг передбачає проведення серійного аналізу. Варіант ВЕРХ на коротких колонках малого діаметра значною міроювідповідає вказаним вимогам. Із застосуванням даного методу авторами розроблено та атестовано методики контролю бенз[a]пірена у трьох природних середовищах: аерозолі, сніговому покриві та поверхневих водах. Для методик характерні: проста уніфікована підготовка проби, що включає екстракцію ПАУ органічними розчинниками і концентрування екстракту, пряме введення сконцентрованого екстракту в хроматографічну колонку, застосування багатохвильового фотометричного детектування в УФ області спектру, ідентифікація піків ПАУ на хроматограмах . Сумарна похибка не перевищує 10 % при визначенні бенз[a]пірена в аерозолі в діапазоні концентрацій від 0.3 до 450 нг/м 3 у поверхневих водах в діапазоні концентрацій від 10 до 1000 нг/л, у сніговому покриві в діапазоні поверхневої щільності. до 50 мкг/м2. Для випадку одночасного визначення пріоритетних ПАУ (до 12 сполук) та реєстрації негомогенних піків аналітів запропоновано повторний поділ екстракту зі зміною селективності рухомої фази, довжини хвилі детектування та температури колонки з урахуванням індивідуальних властивостей ПАУ, що визначається.
1 . Якість навколишнього повітря. Масова концентрація бенз[a]пірена. Методика виконання вимірювань методом ВЕРХ. Свідоцтво про атестацію МВІ №01-2000.
2 . Якість поверхневих та очищених стічних вод. Масова концентрація бенз[a]пірена. Методика виконання вимірювань методом ВЕРХ. Свідоцтво про атестацію МВІ №01-2001.
3 . Якість снігового покриву. Масова концентрація бенз[a]пірена. Методика виконання вимірювань методом ВЕРХ. Свідоцтво про атестацію МВІ №02-2001.
Видалення аніліну з водних розчинів із використанням відходів алюмотермічного відновлення прокатної мідної окалини
Проблема видалення вуглеводнів зі стічних вод є актуальним завданням. У багатьох хімічних, нафтохімічних та інших виробництвах утворюються анілін та його похідні, які є токсичними речовинами. Анілін - сильноотруйна речовина, ГДК - 0,1 мг/м 3 . Анілін та його похідні розчиняються у воді, тому не можуть бути видалені гравітаційним осадженням.
Одним з кращих методів очищення стічних вод від органічних забруднювачів є застосування неорганічних та органічних адсорбентів, здатних регенеруватися (алюмосилікати, модифіковані глини, деревина, волокна і т. д.) і нездатних до регенерації (активоване вугілля, макропористі полімерні матеріали і т.д. ).
Адсорбенти, що регенеруються, можуть видалити з води органічні речовини різної полярності. Пошук ефективних адсорбентів є актуальним завданням.
У цьому повідомленні представлені результати дослідження в галузі застосування прокатної мідної окалини Єреванського кабельного заводу (ОПМОЄрКЗ) як сорбентів аніліну.
Хроматографічні дослідження проводили на хроматографі ВЕРХ / високоефективна рідинна хроматографія / системи (Waters 486 - detector, Waters 600S - controller, Waters 626 - Pump), на колонці 250 х 4 мм наповненими досліджуваними нами сорбентами 1 є досліджувані розчинники/, детектор - UV-254. УФ-спектроскопічний аналіз проведено на спектрофотометрі Specord-50, спектри отримані за допомогою комп'ютерної програми ASPECT PLUS.
Точно зважені порції сорбентів вносили певні обсяги аніліну у воді, початкові концентрації яких варіювали. Суміш ретельно збовтували протягом 6 год. Далі пробу залишали для відстою. Адсорбція завершується практично протягом 48 годин. Кількість осадженого аніліну визначена УФ-спектрофотометричним, а також рефрактометричним аналізом.
Спочатку були досліджені адсорбційні властивості ОПМОЕРКЗ при видаленні аніліну з розчину в тетрахлорметані. Виявилося, що анілін найкраще поглинає сорбент 3 (таблиця).
Проведено також вимірювання для водних розчинів аніліну в концентраціях 0,01-0,0001 моль/л. У таблиці наведено дані з 0,01 М розчину.
Поглинання аніліну різними сорбентами 0,01 М водного розчину аніліну при 20°С
Раніше було встановлено, що адсорбція у зазначених межах концентрацій зростає та лінійно залежить від коефіцієнта заломлення. Кількість аніліну було визначено з графічної залежності «коефіцієнт заломлення – молярна концентрація» та скориговано даними як рідинної хроматографії, так і УФ-спектрального аналізу.
Найбільш активним для водних розчинів є сорбент 3. Кількість адсорбованого забруднювача розраховувалося як різниця між загальною кількістю забруднювача, доданого в початковий розчин, та його залишком у кінцевому розчині.
Методи визначення ПАУ в об'єктах довкілля
Як правило для визначення ПАУ використовуються методи газової хроматографії (ГХ) та високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ). поділ основних 16 ПАУ, достатній для кількісного аналізу, досягається застосуванням або капілярних колонок у газовій хроматографії, або високоефективних колонок, що застосовуються в ВЕРХ. Необхідно пам'ятати, що колонка, яка добре розділяє калібрувальні суміші шістнадцяти ПАУ не гарантує, що вони також добре розділятимуться на тлі супутніх органічних сполук у досліджуваних пробах.
З метою спрощення аналізу, а також для досягнення високої якостіодержуваних результатів більшість аналітичних процедур містить етап попереднього виділення (сепарації) ПАУ серед інших груп супутніх сполук у пробах. Найчастіше в цих цілях використовуються методи рідинної хроматографії низького тиску в системі рідина-тверде тіло або рідина-рідина з використанням механізмів адсорбції, наприклад з використанням силікагелю або окису алюмінію, іноді використовуються змішані механізми, наприклад, адсорбції та винятки із застосуванням сефадексів.
Використання попереднього очищення проб дозволяє при визначенні ПАВ уникнути впливу:
Повністю неполярних сполук, таких як аліфатичні вуглеводні;
Помірно та сильно полярних сполук, наприклад, фталанів, фенолів, багатоатомних спиртів, кислот;
Високомолекулярних сполук, таких, як, наприклад, смоли.
У високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) використовуються переважно два типи детекторів: флуориметричний детектор або спектрофотометричний детектор з фотодіодною лінійкою. Межа виявлення ПАУ при флуориметричному детектуванні дуже низька, що робить цей метод особливо придатним для визначення слідових кількостей поліароматичних сполук. Однак класичні флуориметричні детектори практично не дають інформації про будову з'єднання, що досліджується. Сучасні конструкції уможливлюють реєстрацію спектрів флуоресценції, які характерні для індивідуальних сполук, але вони поки не набули широкого поширення в практиці рутинних вимірювань. Спектрофотометричний детектор з фотодіодною лінійкою (ФДЛ) дає можливість реєстрації спектрів поглинання в УФ і видимому спектральному діапазоні, ці спектри можуть використовуватися для ідентифікації. Аналогічна інформація може бути отримана з використанням детекторів, що швидко сканують.
При виборі аналітичної техніки, призначеної для поділу, ідентифікації та кількісного аналізу згаданих ПАВ необхідно враховувати такі умови:
Рівень визначених змістів у досліджуваних пробах;
Кількість супутніх субстанцій;
Застосовувана аналітична процедура (методика виконання вимірів);
Можливість серійної апаратури.
Розробка методики визначення лужноземельних елементів та магнію методом іонної високоефективної рідинної хроматографії.
Розробка та вдосконалення методів, що дозволяють вирішувати завдання аналізу вод - важлива проблема аналітичної хімії. Розвиток високоефективної рідинної хроматографії високого тискустимулювало розвиток нового напряму в іонообмінній хроматографії - так званої іонної хроматографії. Синтез сорбентів для іонної хроматографії утруднений, оскільки до них пред'являється чимало вимог. У зв'язку з відсутністю комерційно доступних високоефективних катіонітів, була використана динамічно модифікована обернена фаза, для чого був синтезований модифікатор: N-гексадецил-N-деканоїл-параміно-беноілсульфокислоти етил-діізопропіламоній (ДГДАСК), де гідрофобний амін, що містить групу здатний до катіонного обміну. Після пропущення розчину модифікатора поглинання при l = 260 нм досягало 6,4 одиниць оптичної щільності (° Е) з виходом на плато. Розрахована іонообмінна ємність становить 1565 мкмоль. Так як катіони лужноземельних елементів і магнію не поглинають в УФ області спектру, використовувалася непряма УФ детекція із застосуванням синтезованого УФ поглинаючого елюенту 1,4 дипиридинийбутана броміду (ДПБ бромід). Так як галоген-іони руйнують сталеві частини колонки, то бромід-іон 1,4-дипіридінійбутану замінили на ацетат-іон. При промиванні колонки елюентом відбувається заміна протиіону модифікатора-етилдіізопропіламонію на УФ-поглинаючий іон 1,4-дипіридинійбутан. Поділ катіонів здійснювали за оптимальної довжини хвилі l = 260 нм на шкалі 0,4 А в режимі “складання шкали”; полярність самописця змінювали на зворотний. Поділ всіх катіонів, що вивчаються, досягнуто при веденні комплексоутворюючої добавки-щавлевої кислоти. Межі виявлення Mg 2+ Ca 2+ Sr 2+ Ba 2+ становлять 8 мкг/л; 16 мкг/л; 34 мкг/л; 72 мкг/л відповідно. В обраних умовах проаналізовано водопровідну воду, вміст Ca 2+ в якій становить 10,6 +1,9 мг-іон/л, Mg 2+ -2,5 + мг-іон/л. Помилка відтворюваності не перевищує Ca 2+ -2,2%, для Mg 2+ - 1,4%.
Аналіз комплексів кадмію у навколишньому середовищі
Для вивчення механізмів міграції важких металів у біосфері необхідні дані про хімічні форми існування металів у природі. Складнощі при аналізі сполук одного з самих токсичних металів- Кадмія - пов'язані з тим, що він утворює неміцні комплекси, і при спробі їх виділити спотворюються природні рівноваги. У даній роботі сполуки кадмію в ґрунті та рослинах досліджені за допомогою методики, що базується на хроматографічному поділі екстрактів з подальшою ідентифікацією компонентів методами хімічного аналізу. Такий підхід дозволив як ідентифікувати хімічні форми кадмію, а й простежувати їх трансформації в об'єктах довкілля.
З кадмієм в об'єктах біосфери координуються ОН-групи вуглеводів та поліфенолів (включаючи флавоноїди), С=О, фосфати, NH 2 , NO 2 , SH-групи. Для цілей цього дослідження було складено набір модельних лігандів, які представляють ці класи сполук. Взаємодія модельних лігандів з водорозчинними солями кадмію була досліджена методами СФ спектроскопії та ВЕРХ.
Для виділення сполук кадмію використовували екстракцію спеціально підібраними розчинниками (не утворюють комплексів з Cd). Так вдається відокремити кадмій від усіх важких металів, крім його хімічного аналога – цинку. Кадмій- та цинк, що містять піки на хроматограмах отриманих екстрактів, виявляли за допомогою зв'язування металів у вигляді їх дитизонатів. Для відокремлення від цинку використовували відмінність у стійкості комплексів Cd та Zn при рН 6-8. Виділені сполуки Cd ідентифікували методом ВЕРХ із зміною рН у процесі елюювання. Був виконаний аналіз сполук кадмію з компонентами ґрунтів та тканин рослин, а також ідентифіковані речовини, що виробляються рослинами у відповідь на збільшення надходження кадмію із ґрунту. Показано, що у злаків захисними агентами є флавоноїди, зокрема трицин, у бобових – алкоксипохідні цистеїну, у хрестоцвітих – як поліфеноли, так і тіоли.
ГЛАВА 4. АПАРАТУРА ДЛЯ ВЕРХ
СЕРІЯ ACCELA
Новий надвисокоефективний рідинний хроматограф ACCELA здатний працювати в найширшому діапазоні сокростей потоків і тисків, забезпечуючи як типове для ВЕРХ поділ на звичайних колонках, так і надшвидке і ефективне поділ на колонках з розміром частинок сорбенту менше 2 мкм при сверхвы.
Система включає квотернарний градієнтний інетрний насос, здатний створювати тиск понад 1000 атм та з об'ємом затримки всього 65 мкл, що забезпечує високошвидкісний хроматографічний поділ. Автосамплер ACCELAздатний працювати в циклі інжекції зразка 30 секунд і забезпечує високу відтворюваність введення. Діодно-матричний детектор Accela PDAз мінімізованим обсягом проточного осередку (2 мкл) оптимізований для роботи в режимі високошвидкісної хроматографії, використовує патентовану технологію LightPipe і забезпечує збереження симетричної форми піків, що дає використання бездоганних хроматографічної системи та колонок.
Система ідеально з'єднується з мас-спектрометрами для створення найпотужніших та найкращих з доступних у світі систем ВЕРХ/МС.
Колонки для роботи в режимі надвисокоефективної хроматографії з розміром зерна 1.9 мкм доступні від Thermo Electron для будь-яких застосувань.
СЕРІЯ TSP
Модульний принцип побудови приладів ВЕРХ дозволяє замовнику гнучко комплектувати обладнання для вирішення будь-яких аналітичних завдань, а при їх зміні оперативно та економічно його модифікувати. Широкий вибір модулів включає насоси - від ізократичного до чотирикомпонентного градієнтного, від мікроколонного до напівпрепаративного, всі доступні детектори, системи введення зразка - від ручних інжекторів до автосамплерів з можливістю будь-яких маніпуляцій із зразками, потужне програмне забезпечення для обробки результатів. Всі модулі сертифіковані за CSA, TUF/GS, FCC(EMI), VDE (EMI), ISO-9000, вони компактні, мають сучасний дизайн, прості в управлінні, оснащені вбудованим дисплеєм і системою самодіагностики, дозволяють створювати та зберігати в пам'яті методи завдання параметрів. Вони відповідають критеріям "Зразкової Лабораторної Практики" (GLP) та занесені до Реєстру Вимірювальних засобів РФ. Протоколи вимірювань видаються відповідно до Фармакопеїв Англії, США, Німеччини та Франції.
Модульні системи TSP відрізняються високою надійністю та стійкістю в експлуатації.
Поєднання модулів забезпечує аналітика всіма перевагами інтегральної системи, з одного боку, та гнучкістю модульної системи з іншого. У якій би галузі застосування Високоефективної рідкої хроматографії (ВЕРХ) -фармакологія, біотехнологія, аналіз об'єктів навколишнього середовища, клінічний аналіз, аналіз харчових продуктів і напоїв, аналіз нафтохімічної та хімічної продукції - не використовувався цей прилад, він завжди оптимально конфігурується для того, щоб відповідати найвищим вимогам.
Як дослідна, так і високопродуктивна рутинна системи забезпечують:
Високоефективну дегазацію розчинника
Можливість роботи з малими та надмалими кількостями зразка
Найвищу чутливість, як з УФ/ВИД детектором, так і з діодною матрицею (зі знаменитою технологією LightPipe з довжиною оптичного шляху 1 або 5 см на вибір)
Роботу з різними колонками
Високу точність кількісного аналізу
Можливість автоматичної роботи з різними обсягами зразка
Середньоквадратичну помилку за часом утримання менше 0.3%
Мінімальну робочу площу, що займається системою
Високу надійність та стабільність параметрів.
Surveyor LC Pump- ВЕРХ насос, що має кращі показники відтворюваності часів утримання серед усіх доступних у світі чотирикомпонентних градієнтних насосів. Інтегрований чотириканальний вакуумний дегазатор та демпфер пульсацій забезпечують чудову стабільність базової лінії для досягнення максимальної чутливості та точності кількісного аналізу.
Автодозатор забезпечує високу продуктивність та гнучкість аналізу. Широкий вибір піддонів для зразків - від стандартних віал до 96- та 384-лункових мікропластин - покриває потреби практично всіх застосувань. Нова технологіязабезпечує введення проби практично без втрат, практично 5 мкл зразка вводяться автодозатор з повного обсягу зразка в 5 мкл.
SURVEYOR
УФ/вид детектор і PDA (детектор з діодною матрицею)
Surveyor UV/Vis- детектор ультрафіолетового та видимого світла зі змінною довжиною хвилі є комбінацією економічності та надійності з найвищою чутливістю LightPipe технології. Широкий вибір проточних кювет робить цей детектор універсальним для всіх застосувань від тих, що використовують капілярну або мікроколоночну хроматографію до напівпрепаративних та препаративних.
Surveyor PDAдетектор є найчутливішим серед усіх ВЕРХ детекторів, які використовують діодну матрицю. Оптика з дволамповим джерелом покриває безперервно весь діапазон довжин хвиль від 190 до 800 нм. Волоконно-оптичний формувач світлового пучка забезпечує чудовий оптичний дозвіл без принесення в жертву чутливості.
Surveyor RIрефрактометричний детектор із термостатованою кюветою мінімального об'єму з повним електронним контролем із комп'ютера.
Surveyor FLфлуориметричний скануючий детектор з високою чутливістю та можливістю детекції при флюоресценції, хемілюмінесценції та фосфоресценції.
Широкий вибір автосемплерів дозволяє працювати як зі звичайними віалами, так і 96-позиційними планшетами, що широко використовуються в біохімії та клінічній практиці. p align="justify"> Робота з ними полегшується завдяки застосуванню аналогічних планшетів для підготовки проб методом твердофазної екстракції.
400 Електричний привід, петля Valco (20 мкл – стандарт) з можливістю часткового заповнення.
Карусель 96 зразків.
Електричний привід, термостат колонки, петля Valco (100 мкл – стандарт) з можливістю часткового заповнення. Режим AutoMix для підготовки проб. Карусель для зразків: 84 х 2 мл (зразки) + Зх 10 мл (реагенти). Вбудований термостат стовпчика. 420
Петлевий автосемплер для дослідницьких робітз можливістю роботи в режимах повного, часткового заповнення та введення мікролітрових проб. Широкий вибір каруселів (стандартна – 96 зразків).
Планшетний автосемплер для роботи з 96- та 384-позиційними планшетами. Введення проби в петлю під тиском, можливість введення проб не менше 1 мкл. Можливість встановлення податчика планшетів. ВЕРХ
Основні виробники обладнання для ВЕРХ
· Waters – надпродуктивна хроматографія, мас-спектрометрія, колонки, твердофазна екстракція;
· Varian, Inc. - хроматографи та колонки, аксесуари для твердофазної екстракції;
· Agilent Technologies - хроматографи та колонки;
· Hypersil - колонки та сорбенти.
· Merck KGaA - ТСХ пластини та аксесуари для ТСХ, колонки, сорбенти рухомі фази для ВЕРХ, аксесуари для твердофазної екстракції
· Dionex - обладнання та колонки для ВЕРХ, особливо для іонної хроматографії.
Література
1.Пилипенко А.Т., П'ятницький І.В. Аналітична хімія. У двох книгах: кн..1 - М.: Хімія, 1990-480с.
1. Пилипенко А.Т., П'ятницький І.В. Аналітична хімія. У двох книгах: кн..2 - М.: Хімія, 1990-480с.
2. Васильєв В.П. Аналітична хімія. У 2 год. Ч. 2. Фізико - хімічні методи аналізу: Навч. для Хімка – технол. спец. вишів. - М.: Вищ. шк., 1989. - 384с.
3. Гідрохімічні матеріали. Том 100. Методи та технічні засоби оперативного моніторингу якості поверхневих вод. Л.: Гідрометео-видав, 1991. - 200с.
4. Лур'є Ю.Ю. Аналітична хімія виробничих стічних вод/Ю.Ю. Лур'є; М.: ХіміяЮ, 1984. - 448с.
5. Юінг Г. Інструментальні методи хімічного аналізу/Пер. з англ. М.: Світ, 1989. - 348 с.
6. Горелік Д.О., Конопелько Л.А., Панков Е.Д. Екологічний моніторинг. У 2 т. СПб.: Крісмас. 2000. - 260 с.
7. Айвазов Б.В. Введення у хроматографію. М: Вища. шк., 1983. - 450 с.
8. Гольдберг К.А., Вігдергауз М.С. Введення у газову хроматографію. М.: Хімія, 1990. - 329 с.
9. Столяров Б.В. та ін // Практична газова та рідинна хроматографія. СПб.: СПбГУ, 1998. – С. 81.
11. Горшков А.Г., Маринайте І.І. ВЕРХ – метод моніторингу ПАУ в об'єктах навколишнього середовища
12. Торосян Г. О., Мартіросян В. А., Алексанян А. Р., Закарян М. О.
13. Л.А. Туркіна, Г.М. Корольова Розробка методики визначення лужноземельних елементів та магнію методом іонної високоефективної рідинної хроматографії
14. Дульцева Г.Г., Дубцова Ю.Ю., Скубнєвська Г.І. Аналіз комплексів кадмію у навколишньому середовищі
додаток
ВИЗНАЧЕННЯ КЛОМАЗОНУ У ВОДІ ХРОМАТОГРАФІЧНИМИ МЕТОДАМИ
МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ МУК 4.1.1415-03
1. Підготовлено: Федеральним науковим центром гігієни ім. Ф.Ф.
Ерісмана; Московською сільськогосподарською академією ім. К.А.
Тимірязєва; за участю Департаменту Держсанепіднагляду МОЗ Росії. Розробники методики вказані наприкінці.
3. Затверджено Головним державним санітарним лікарем
Російської Федерації, Першим заступником Міністра охорони здоров'я Російської Федерації, акад. РАМН Г.Г. Онищенка 24 червня 2003 р.
5. Введені вперше.
1. Вступна частина
Фірма-виробник: ФМС (США).
Торгова назва: КОММАНД.
Діюча речовина: кломазон.
2-(2-хлорбензил)-4,4-диметил-3-ізоксалідин-3-он(ІЮПАК)
Світло-коричнева в'язка рідина.
Температура плавлення: 25-С.
Температура кипіння: 275-С.
Тиск пару при 25-С: 19,2 мПа.
Коефіцієнт розподілу н-октанол/вода K logP = 2,5.
Добре розчинний в ацетоні, гексані, етанолі, метанолі,
хлороформі, дихлорметані та ацетонітрилі; розчинність у воді -
1,10 г/куб. дм. Стабільний при кімнатній температурі щонайменше 2 років, при 50 -З - щонайменше 3 місяців.
Коротка токсикологічна характеристика: Гостра пероральна
токсичність (LD) для щурів – 1369 – 2077 мг/кг; гостра дермальна
токсичність (LD) для щурів – понад 2000 мг/кг; гостра
інгаляційна токсичність (LC) для щурів – 4,8 мг/куб. дм (4 год).
Гігієнічні нормативи. ГДК у воді – 0,02 мг/куб. дм.
Область застосування препарату. Кломазон - гербіцид вибіркової дії, що застосовується для боротьби зі злаковими та дводольними бур'янами в посівах сої та рису при довсходовом або передпосівному внесенні.
2. Методика визначення кломазону у воді
хроматографічними методами
2.1. Основні положення
2.1.1. Принцип методики
Методика заснована на вилученні кломазону з аналізованої проби гексаном, концентруванні екстракту та подальшому кількісному визначенні альтернативними методами:
високоефективною рідинною хроматографією (ВЕРХ) з
ультрафіолетовим детектором, газорідинною хроматографією (ГЖХ) з детектором постійної швидкості рекомбінації або тонкошаровою хроматографією (ТСХ). Кількісне визначення проводиться методом абсолютного калібрування.
2.1.2. Вибірковість методу
У пропонованих умовах метод специфічний у присутності глобальних забруднювачів навколишнього середовища: хлорпохідні циклопарафінів (ізомери ГХЦГ), сполук дифенільного ряду (ДДТ та його похідні), їх метаболітів - поліхлорованих бензолів і фенолів, а також у присутності трихлорацетату якість гербіциду.
2.1.3. Метрологічна характеристика методу (Р = 0,95)
Реактиви, розчини та матеріали
Кломазон із вмістом буд. 99,8%
(ФМС, США)
Азот, оч ГОСТ 9293-79
Аміак водний, 25%-ний, ч ГОСТ 1277-81
Ацетон, ч ГОСТ 2603-79
н-Гексан, ч ГОСТ 2603-79
Водню пероксид, 30%-ний водний розчин ГОСТ 10929-77
Ізопропіловий спирт, хч ТУ 6-09-402-75
Кислота сірчана, хч ГОСТ 4203-77
Кислота хлороводнева (соляна), хч ГОСТ 3118-77
Метиловий спирт, хч ГОСТ
Натрію гідроксид, хч, 25% водний розчин ГОСТ 4323-77
Натрію сульфат безводний, хч ГОСТ 1277-81
Срібла нітрат, хч ГОСТ 1277-81
2-Феноксіметанол, год ТУ 6-09-3688-76
Хроматон N-AW-DMCS (0,16 – 0,20 мм)
з 5% SE-30, Хемапол, Чехія
Хроматон N-AW-DMCS (0,16 – 0,20 мм) з 1,5
ОV-17 + 1,95% QF-1, Хемапол, Чехія
Платівки для ВЕТСГ (СРСР)
Платівки "Кізельгель 60 F-254" (ФРН)
Платівки "Силуфол" Чехія
Паперові фільтри "біла стрічка", знезолені та попередньо промиті гексаном ТУ 6-09-2678-77
2.3. Прилади, апаратура, посуд
Рідкісний хроматограф Міліхром
з ультрафіолетовим детектором
Хроматографічна колонка сталева,
довжиною 64 мм, внутрішнім діаметром 2 мм,
заповнена Силасорб 600, зерненням 5 мкм
Хроматограф газовий серії "Колір" або
аналогічний, з детектором постійної
швидкості рекомбінації (ДПР) з межею
детектування за лінданом 4 x 10 г/куб. см
Хроматографічна колонка скляна, довжиною
1 або 2 м, внутрішнім діаметром 2 – 3 мм
Мікрошприц типу МШ-10, місткістю 10 мкл ТУ 5Е2-833-024
Апарат для струшування типу АВУ-6С ТУ 64-1-2851-78
Лазня водяна ТУ 64-1-2850-76
Ваги аналітичні типу ВЛА-200 ГОСТ 34104-80Е
Камера хроматографічна ГОСТ 10565-74
Насос водоструминний ГОСТ 10696-75
Опромінювач ртутно-кварцовий типу ОКН-11 ТУ 64-1-1618-77
Пульверизатори скляні ГОСТ 10391-74
Ротаційний вакуумний випарник ІР-1М
або аналогічний ТУ 25-11-917-76
Установка компресорна ТУ 64-1-2985-78
Шафа сушильна ТУ 64-1-1411-76Е
Вирви ділильні ГОСТ 3613-75
Колби мірні місткістю 100 мл ГОСТ 1770-74
Циліндри мірні, місткістю 10, 50 мл ГОСТ 1770-74Е
Колби грушоподібні зі шліфом,
місткістю 100 мл ГОСТ 10394-72
Колби конічні місткістю 100 мл ГОСТ 22524-77
Пробірки центрифужні, мірні ГОСТ 25336-82Е
Піпетки, місткістю 0,1, 1, 2, 5 та 10 мл ГОСТ 20292-74
Вирви хімічні, конусні, діаметром
34 - 40 мм ГОСТ 25336-82Е
2.4. Відбір проб
Відбір, зберігання та підготовка проб проводяться відповідно до
"Уніфікованими правилами відбору проб сільськогосподарської продукції, харчових продуктів та об'єктів довкілля для визначення мікрокількостей пестицидів", затвердженими за N 2051-79 від 21.08.79
Відібрані проби можна зберігати у холодильнику трохи більше 5 днів. Перед аналізом воду (за наявності суспензії) фільтрують через нещільний паперовий фільтр.
2.5. Підготовка до визначення
2.5.1. Метод ВЕРХ
2.5.1.1. Підготовка рухомої фази для ВЕРХ
У мірну колбу місткістю 100 мл поміщають за допомогою піпетки 5 мл ізопопанолу та 5 мл метанолу, доливають до мітки гексаном, перемішують, фільтрують.
2.5.1.2. Кондиціювання колонки
Промити колонку для ВЕРХ сумішшю гексан-метанол-ізопропанол (90:5:5, за обсягом) протягом 30 хв. при швидкості подачі розчинника 100 мкл/хв.
2.5.2. Метод ГЖХ. Підготовка та кондиціювання колонки
Готову насадку (5% SE-30 на Хроматоні N-AW-DMCS) засипають у скляну колонку, ущільнюють під вакуумом, колонку встановлюють у термостаті хроматографа, не під'єднуючи до детектора, і стабілізують в струмі азоту при температурі 250 -3 протягом 10 12 год.
2.5.3. Метод ТСХ
2.5.3.1. Приготування реагентів, що виявляють
2.5.3.1.1. Реагент, що виявляє N 1
1 г нітрату срібла розчиняють в 1 мл дистильованої води, додають 10 мл 2-феноксиметанолу, 190 мл ацетону, 1 - 2 краплі пероксиду водню, розчин перемішують і переносять у склянку темного скла.
2.5.3.2.2. Проявляє реагент N 2
0,5 г нітрату срібла розчиняють у 5 мл дистильованої води в мірній колбі на 100 мл, додають 10 мл 25% водного аміаку, розчин доводять до 100 мл ацетоном, перемішують і переносять у склянку з темного скла.
2.5.3.2. Приготування рухомої фази для ТШХ
У мірну колбу місткістю 100 мл вносять 20 мл ацетону і додають до мітки гексан, перемішують. Суміш наливають у хроматографічну камеру шаром трохи більше 6 - 8 мм за 30 хв. До початку хроматографування.
2.5.4. Приготування стандартних розчинів
Основний стандартний розчин кломазону з вмістом 100 мкг/мл готують розчиненням 0,010 г препарату, що містить 99,8% д. в., в гексані у мірній колбі на 100 мл. Розчин зберігається у холодильнику протягом місяця.
Робочі стандартні розчини з концентрацією 0,4; 1,0; 2,0; 4,0; 10,0; 20 та 40,0 мкг/мл готують з основного стандартного розчину кломазону відповідним послідовним розведенням гексаном.
Робочі розчини зберігають у холодильнику трохи більше місяця.
2.5.5. Побудова градуювального графіка
2.5.5.1. Градуювальний графік А (вимірювання за п. 2.7.1, ВЕРХ)
Для побудови градуювального графіка інжектор хроматографа вводять по 5 мкл робочого стандартного розчину кломазону з концентрацією 4,0; 10,0; 20,0 та 40 мкг/мл.
2.5.5.2. Градуювальний графік (вимірювання за п. 2.7.2, ГЖХ)
Для побудови градуювального графіка випарник хроматографа вводять по 5 мкл робочого стандартного розчину кломазону з концентрацією 0,4; 1,0; 2,0; 4,0 та 10,0.
Здійснюють не менше 5 паралельних вимірів. Знаходять середнє значення висоти хроматографічного піку кожної концентрації. Будують градуювальний графік (А або В) залежності висоти хроматографічного піку мм від концентрації кломазону в розчині в мкг/мл.
2.6. Опис визначення
100 мл аналізованої проби води поміщають у ділильну вирву місткістю 250 мл, доливають 10 мл 25%-ного водного розчину гідроксиду натрію, перемішують і додають 20 мл н-гексану. Воронку струшують протягом 3 хв., після поділу фаз гексановий шар зливають в грушоподібну колбу місткістю 100 мл, пропускаючи через шар безводного сульфату натрію, поміщеного в конічній воронці на складчастому паперовому фільтрі. Вилучення препарату з водної проби повторюють ще двічі, використовуючи 20 мл н-гексану. Об'єднаний гексановий екстракт упарюють на ротаційному вакуумному випарнику при температурі 40 -З майже насухо, залишок віддувають потоком повітря або азоту особливої чистоти. Сухий залишок розчиняють у 0,1 (ВЕРХ, ТШХ) або 0,25 мл (ГРХ) н-гексану і аналізують одним із хроматографічних методів.
2.7. Умови хроматографування
Рідкісний хроматограф з ультрафіолетовим детектором Міліхром (Росія).
Колонка сталева довжиною 64 мм, внутрішнім діаметром 2 мм,
заповнена Силасорб 600, зерненням 5 мкм.
Температура стовпчика: кімнатна.
Рухлива фаза: гексан-ізопропанол-метанол (90:5:5, за обсягом).
Швидкість потоку елюентів: 100 мкл/хв.
Довжина хвилі: 240 нм.
Чутливість: 0,4 од. абсорбції на шкалу.
Об'єм проби, що вводиться: 5 мкл.
Час виходу кломазону: близько 6 хв.
Лінійний діапазон детектування: 20 – 200 нг.
Зразки, що дають піки більші, ніж стандартний розчин з концентрацією 40 мкг/мл, розбавляють рухомий фазою ВЕРХ.
Хроматограф газовий "Колір-570" з детектором постійної швидкості рекомбінації іонів.
Колонка скляна довжиною 1 м, внутрішнім діаметром 3 мм, заповнена Хроматон N-AW-DMCS з 5% SE-30 (0,16 - 0,20 мм).
Робоча шкала електрометра 64 х 10 10Ом.
Швидкість руху стрічки самописця 200 мм/год.
Температура термостата колонки – 190-С
детектора - 300-С
випарника - 220-С
Швидкість газу-носія (азота) – 60 мл/хв.
Об'єм проби, що вводиться - 5 мкл.
Час виходу кломазону – 2,5 хв.
Лінійний діапазон детектування: 2 – 50 нг.
Зразки, що дають піки більші, ніж стандартний розчин з концентрацією 10 мкг/мл, розбавляють гексаном.
Для підвищення точності ідентифікації кломазону при спільній присутності в пробі гамма-ГХЦГ, що має найближчий час утримання, кломазон видаляється з проби обробкою концентрованою сірчаною кислотою. Повторний аналіз проби дозволяє встановити вклад кломазону у первинний хроматографічний сигнал.
Гексановий розчин у колбі, отриманий за п. 2.6 кількісно
(або його аліквотну частину) наносять на хроматографічні пластинки "Силуфол", "Кізельгель 60F-254" або "Пластинки для ВЕТСХ". Поряд наносять стандартні розчини в об'ємі, що відповідає вмісту кломазону 1, 2, 5 та 10 мкг. Пластинку поміщають у камеру для хроматографування, що містить суміш н-гексан-ацетон (4:1 за обсягом). Після розвитку хроматограми платівку виймають з камери, поміщають її під тягу до випаровування розчинників, потім обробляють одним з реагентів, що виявляють, і поміщають під ультрафіолетову лампу на 5 хв. Зона локалізації препарату на пластинках "Силуфол", "Пластинках для ВЕТСХ" та "Кізельгель 60F-254" проявляється у вигляді сіро-бурих плям з величиною Rf 0,35, 0,85 та 0,43, відповідно. Для визначення кломазону методом ТСХ можна використовувати платівки "Алюграм" та "Поліграм" (виробництва ФРН). Величина Rf кломазону цих пластинках становить 0,37 і 0,38, відповідно.
3. Вимоги техніки безпеки
Необхідно дотримуватись загальноприйнятих правил безпеки при роботі з органічними розчинниками, токсичними речовинами, електронагрівальними приладами.
4. Контроль похибки вимірів
Оперативний контроль похибки та відтворюваності вимірювань здійснюється відповідно до рекомендацій МІ 2335-95. ДСМ "Внутрішній контроль якості результатів кількісного хімічного аналізу".
5. Розробники
Юдіна Т.В., Федорова Н.Є. (ФНЦГ ім. Ф.Ф. Ерісмана).
Давидюк О.І. (УкрНДІГІНТОКС, м. Київ); Кісенко М.А., Демченко В.Ф. (Інститут медицини праці АН та АМН України, м. Київ).
Рідинно-адсорбційна хроматографія на колонці
Поділ суміші речовин в адсорбційній колонці відбувається в результаті відмінності їх у сорбируемости на даному адсорбенті (відповідно до закону адсорбційного заміщення, встановленого М. С. Колір).
Адсорбентами є пористі тіла з сильно розвиненою внутрішньою поверхнею, що утримують рідини за допомогою міжмолекулярних та поверхневих явищ. Це можуть бути полярні та неполярні неорганічні та органічні сполуки. До полярних адсорбентів відносяться силікагель (висушений желатиноподібний двоокис кремнію), оксид алюмінію, карбонат кальцію, целюлоза, крохмаль та ін. Неполярні сорбенти - активоване вугілля, порошок гуми та безліч інших, отриманих синтетичним шляхом.
До адсорбентів пред'являють такі вимоги: S вони не повинні вступати в хімічні реакції з рухомою фазою і речовинами, що розділяються; S повинні мати механічну міцність; S зерна адсорбенту мають бути однакового ступеня дисперсності.
При виборі умов для хроматографічного процесу враховують властивості адсорбенту та речовин, що адсорбуються.
У класичному варіанті рідинної колонкової хроматографії (ЖКГ) через хроматографічну колонку, що є скляною трубкою діаметром 0,5 - 5 см і довжиною 20 - 100 см, заповнену сорбентом (НФ), пропускають елюенти (ПФ). Елюент рухається під впливом сили тяжіння. Швидкість його руху можна регулювати краном, що є внизу колонки. Аналізовану суміш поміщають у верхню частину колонки. У міру просування проби колонкою відбувається поділ компонентів. Через певні проміжки часу відбирають фракції елюентів, що виділився з колонки, який аналізують яким-небудь методом, що дозволяє вимірювати концентрації визначених речовин.
Колонкова адсорбційна хроматографія нині застосовується, переважно як самостійний метод аналізу, бо як спосіб попереднього (іноді і кінцевого) поділу складних сумішей більш прості, тобто. для підготовки до аналізу іншими методами (у тому числі хроматографічними). Наприклад, на колонці з окисом алюмінію розділяють суміш токоферолов, пропускають елюенти і збирають фракцію а-токоферолу для подальшого визначення фотометричним методом.
Хроматографічне розподіл суміші на колонці внаслідок повільного просування ПФ займає багато часу. Для прискорення процесу хроматографування проводять під тиском. Цей метод називають високоефективною рідинною хроматографією (ВЖХ)
Модернізація апаратури, що застосовується в класичній рідинній колонковій хроматографії, зробила її одним з перспективних і сучасних методіваналізу. Високоефективна рідинна хроматографія є зручним способом поділу, препаративного виділення та проведення якісного та кількісного аналізу нелетких термолабільних сполук як з малою, так і з великою молекулярною масою.
Залежно від типу сорбенту в даному методі використовують 2 варіанти хроматографування: на полярному сорбенті з використанням неполярного елюенту (варіант прямої фази) і на неполярному сорбенті з використанням полярного елюенту - так звана об-ращенно-фазова високоефективна рідинна хроматографія (Оф ВЖХ).
При переході елюентів до елюентів рівновага в умовах ОфВЖХ встановлюється набагато швидше, ніж в умовах полярних сорбенгів і неводних ПФ. Внаслідок цього, а також зручності роботи з водними та водно-спиртовими елюентами, ОфВЖХ набула нині великої популярності. Більшість аналізів за допомогою ВЖХ проводять саме цим методом.
Апаратура для ВЖХ
Комплект сучасного обладнання для ВЖХ, як правило, складається з двох насосів 3,4 (рис. 7.1.1.1), що керуються мікропроцесором 5, і подають елюенти за певною програмою. Насоси утворюють тиск до 40 МПа. Проба вводиться через спеціальний пристрій (інжектор) безпосередньо в потік елюентів. Після проходження через хроматографічну колонку 8 речовини детектуються високочутливим проточним детектором 9 сигнал якого реєструється і обробляється мікро-ЕОМ 11. При необхідності, в момент виходу піку автоматично відбираються фракції.
Колонки для ВЖХ виконують з нержавіючої сталі із внутрішнім діаметром 2 - 6 мм і довжиною 10-25 см. Колонки заповнюють сорбентом (НФ). Як НФ використовуються силікагель, оксид алюмінію або модифіковані сорбенти. Модифікують зазвичай силікагель, впроваджуючи хімічним шляхом у його поверхню різні функціональні групи.
детектори. Реєстрація виходу з колонки окремого компонента провадиться за допомогою детектора. Для реєстрації можна використовувати зміну будь-якого аналітичного сигналу, що йде від рухомої фази та пов'язаного з природою та кількістю компонента суміші. У рідинній хроматографії використовують такі аналітичні сигнали, як світлопоглинання або світловиділення вихідного розчину (фотометричні та флуориметричні детектори), показник заломлення (рефрактометричні детектори), потенціал та електрична провідність (електрохімічні детектори) та ін.
Безперервно детектований сигнал реєструється самописцем. Хро-матограма є зафіксовану на стрічці самописця послідовність сигналів детектора, що виробляються при виході з колонки окремих компонентів суміші. У разі поділу суміші на зовнішній хроматограмі видно окремі піки. Положення піку на хромато-грамі використовують з метою ідентифікації речовини, висоту або площу піку - для цілей кількісного визначення.
Якісний аналіз
Найважливіші характеристики хроматограми - час утримування tR і пов'язаний з нею утримуваний обсяг - відбивають природу речовин, їх здатність до сорбції на матеріалі нерухомої фази і, отже, за умов хроматографування є засобом ідентифікації речовини. Для даної колонки з певними швидкістю потоку і температурою час утримування кожного з'єднання постійно (рис.7.1.1.2), де t.R(A) - час утримування компонента А аналізованої суміші з моменту введення в колонку до появи на виході з колонки максимуму піку, 1К( вс) - час утримування внутрішнього стандарту (спочатку відсутня в аналізованій суміші речовина), h - висота піку (мм), аш - ширина піку на половині його висоти, мм.
Для ідентифікації речовини хроматограмою зазвичай використовують стандартні зразки або чисті речовини. Порівнюють час утримання невідомого компоненту IR* з часом утримування IRCT відомих речовин. Але більш надійна ідентифікація щодо вимірювання відносного часу утримування
При цьому в колонку спочатку вводять відому речовину (внутрішній стандарт) і вимірюють час його утримування tR(Bc), потім хроматографічно розділяють (хроматографують) досліджувану суміш, яку попередньо додають внутрішній стандарт. Відносний час утримання визначають за формулою (7.1.1.1).
Кількісний аналіз
В основі цього аналізу лежить залежність висоти піку або його площі S від кількості речовини. Для вузьких піків краще вимір h, для широких розмитих - S. Площа піку вимірюють різними способами: множенням висоти піку (h) на його ширину (ai/2), виміряну на половині його висоти (рис.7.2.3); планиметрування; за допомогою інтегратора. Електричними чи електронними інтеграторами забезпечені сучасні хроматографи.
Для визначення вмісту речовин у пробі використовують переважно три методи: метод абсолютної градуювання, метод внутрішньої нормалізації та метод внутрішнього стандарту.
Метод абсолютного градуювання ґрунтується на попередньому визначенні залежності між кількістю введеної речовини та площею або висотою піку на хроматограмі. У хроматограму вводять відому кількість градуювальної суміші і визначають площі або висота отриманих піків. Будують графік залежності площі чи висоти піку від кількості введеної речовини. Аналізують досліджуваний зразок, вимірюють площу або висоту піку компонента, що визначається і на підставі градувального графіка розраховують його кількість.
Цей метод дає інформацію лише щодо відносного вмісту компонента в суміші, але не дозволяє визначити його абсолютну величину.
Метод внутрішнього стандарту заснований на порівнянні вибраного параметра піку аналізованої речовини з тим самим параметром стандартної речовини, введеної в пробу у відомій кількості. У досліджувану пробу вводять відому кількість такої стандартної речовини, пік якої досить добре відокремлюється від піків компонентів досліджуваної суміші
В останніх двох методах потрібно введення поправочних коефіцієнтів, що характеризують чутливість використовуваних детекторів до аналізованих речовин. Для різних типів детекторів та різних речовин коефіцієнт чутливості визначається експериментально.
У рідинної адсорбційної хроматографії використовується також аналіз фракцій розчинів, зібраних у момент виходу з колонки речовини. Аналіз може бути проведений різними фізико-хімічними методами.
Рідинну адсорбційну хроматографію застосовують насамперед для поділу органічних речовин. Цим методом дуже успішно вивчають склад нафти, вуглеводнів, ефективно поділяють-транс- та цис-ізомери, алкалоїди та ін. За допомогою ВЖХ можна визначати барвники, органічні кислоти, амінокислоти, цукру, домішки пестицидів та гербіцидів, лікарських речовин та інших забруднювачів у харчових продукти.
(ОФС 42-0096-09)
Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) – це метод колонкової хроматографії, в якому рухомий фазою (ПФ) служить жид-
кістка, що рухається через хроматографічну колонку, заповнену непід-
вижною фазою (сорбентом). Колонки для ВЕРХ характеризуються високим гідравлічним тиском на вході в колонку, тому ВЕРХ іноді називають
ють «рідинною хроматографією високого тиску».
Залежно від механізму поділу речовин розрізняють таку-
щі варіанти ВЕРХ: адсорбційну, розподільчу, іонообмінну,
ексклюзивну, хіральну та ін.
В адсорбційній хроматографії поділ речовин відбувається за рахунок їх різної здатності адсорбуватися і десорбуватися з по-
верхності адсорбенту з розвиненою поверхнею, наприклад силікагелю.
У розподільчій ВЕРХ поділ відбувається за рахунок відмінності коефіцієнтів розподілу речовин, що розділяються між нерухомою
(як правило, хімічно прищепленої до поверхні нерухомого носія) та
рухомий фазами.
За полярністю ПФ і НФ ВЕРХ поділяють на нормально-фазову та об-
ращенно-фазову.
Нормально-фазовим називають варіант хроматографії, в якому вико-
користуються полярний сорбент (наприклад, силікагель або силікагель з при-
крученими NH2 - або CN-групами) і неполярна ПФ (наприклад, гексан з раз-
особистими добавками). У звернено-фазовому варіанті хроматографії вико-
користуються неполярними хімічно модифікованими сорбентами (наприклад,
неполярний алкільний радикал C18 ) і полярні рухомі фази (наприклад,
метанол, ацетонітрил).
В іонообмінній хроматографії молекули речовин суміші, дисоці-
що вали в розчині на катіони та аніони, поділяються при русі через
сорбент (катіоніт або аніоніт) за рахунок їх різної швидкості обміну з іонними
ми групами сорбенту.
В екслюзійній (ситової, гель-проникаючої, гель-фільтраційної)
хроматографії молекули речовин поділяються за розміром за рахунок їхньої різної здатності проникати в пори нерухомої фази. При цьому першими з ко-
лонки виходять найбільші молекули (з найбільшою молекулярною масою), здатні проникати в мінімальне число пір нерухомої фази,
а останніми виходять речовини з малими розмірами молекул.
Часто поділ протікає не по одному, а по кількох механізмах одночасно.
Метод ВЕРХ може застосовуватися для контролю якості будь-яких нега-
подібних аналізованих речовин. Для аналізу використовують відповідні прилади – рідинні хроматографи.
До складу рідинного хроматографа зазвичай входять такі основ-
ні вузли:
– вузол підготовки ПФ, включаючи ємність з рухомою фазою (або ємно-
сти з окремими розчинниками, що входять до складу рухомої фа-
зи) та систему дегазації ПФ;
– насосна система;
– змішувач рухомої фази (за потреби);
– система введення проби (інжектор);
– хроматографічна колонка (може бути встановлена в термостаті);
– детектор;
– система збору та обробки даних.
Насосна система
Насоси забезпечують подачу ПФ у колонку із заданою постійною швидкістю. Склад рухомої фази може бути постійним або змінюва-
ним під час аналізу. У першому випадку процес називають ізократичним,
а у другому – градієнтним. Перед насосною системою інколи встановлюють
фільтри з діаметром пір 0,45 мкм для фільтрації рухомої фази. Сучасні-
Насосна система рідинного хроматографа складається з одного або декількох насосів, керованих комп'ютером. Це дозволяє міняти зі-
ставши ПФ за певною програмою при градієнтному елююванні. Смі-
шення компонентів ПФ в змішувачі може відбуватися як при низькому тиску.
лені (до насосів), так і при високому тиску (після насосів). Змішувач можна використовувати для підготовки ПФ і при ізократичному елююванні,
однак більш точне співвідношення компонентів досягається при попередньому
ном змішуванні компонентів ПФ для ізократичного процесу. Насоси для аналітичної ВЕРХ дозволяють підтримувати постійну швидкість подачі ПФ колонку в інтервалі від 0,1 до 10 мл/хв при тиску на вході в колонку до 50 МПа. Доцільно, однак, щоб це значення не перевищувало
шало 20 МПа. Пульсації тиску мінімізуються спеціальними демп-
ферними системами, що входять до конструкції насосів. Робочі деталі на-
сосів виготовляються з корозійностійких матеріалів, що дозволяє використовувати у складі ПФ агресивні компоненти.
Змішувачі
За своєю конструкцією змішувачі можуть бути статичними або динамічними.
ними.
У змішувачі відбувається утворення єдиної рухомої фази з від-
дільних розчинників, що подаються насосами, якщо необхідна суміш не була приготовлена заздалегідь. Змішування розчинників зазвичай відбувається мимовільно, але іноді застосовуються системи з примусовим сумішшю.
шивання.
Інжектори
Інжектори можуть бути універсальними для введення проб від
1 мкл до 2 мл або дискретними для введення проби тільки певного об'єму.
ема. Обидва типи інжекторів можуть бути автоматичними (автоінжектори або автосемплери). Інжектор для введення проби (розчину) розташований не-
посередньо перед хроматографічною колонкою. Конструкція інжектора дозволяє змінювати напрямок потоку ПФ та здійснювати попереднє введення проби у петлю певного об'єму (зазвичай від 10 до 100 мкл).
Цей обсяг вказано на маркуванні петлі. Конструкція інжектора дозволяє заміну петлі. Для введення аналізованого розчину в неав-
томатичний інжектор використовується ручний мікрошприц з об'ємом,
тельно перевершує обсяг петлі. Надлишок введеного розчину, не по-
що розміщується в петлі, скидається, і в колонку вводиться точний і завжди однаковий обсяг проби. Ручне неповне заповнення петлі знижує точ-
ність і відтворюваність дозування і, отже, погіршує точ-
ність та відтворюваність хроматографічного аналізу.
Хроматографічна колонка
Хроматографічні колонки зазвичай являють собою трубки з нержавіючої сталі, скла або пластику, заповнені сорбентом і закри-
ті з обох сторін фільтрами з діаметром пор 2-5 мкм. Довжина аналітично-
ської колонки в залежності від механізму хроматографічного поділу може перебувати в діапазоні від 5 до 60 см і більше (зазвичай вона становить
10-25 см), внутрішній діаметр - від 2 до 10 мм (зазвичай 46 мм). Колонки з внутрішнім діаметром менше 2 мм використовуються в мікроколонкової хрому.
тографії. Використовуються також капілярні колонки з внутрішнім діамет-
ром близько 0,3-0,7 мм. Колонки для препаративної хроматографії мають внутрішній діаметр 50 мм і більше.
Перед аналітичною колонкою можуть встановлюватися короткі ко-
лонки (предколонки) виконують різні допоміжні функції
(Чаще - захист аналітичної колонки). Зазвичай аналіз проводять при ком-
натній температурі, проте для збільшення ефективності поділу і со-
покращення тривалості аналізу може бути використане термоста-
вання колонок при температурах не вище 60 С. При більш високих температурахможлива деструкція сорбенту та зміна складу ПФ.
Нерухома фаза (сорбент)
Як сорбенти зазвичай застосовуються:
1. Силікагель, оксид алюмінію, пористий графіт використовуються в нор-
мально-фазової хроматографії. Механізм утримування в даному слу-
чаї - зазвичай адсорбція;
2. Смоли або полімери з кислотними чи основними групами. Область застосування – іонообмінна хроматографія;
3. Пористий силікагель або полімери (ексклюзивна хроматографія);
4. Хімічно модифіковані сорбенти (сорбенти з щепленими фа-
зами), приготовані найчастіше на основі силікагелю. Механізм утримування в більшості випадків - розподіл між рухомих-
ної та нерухомої фазами;
5. Хімічно модифіковані хіральні сорбенти, наприклад вироб-
водні целюлози та амілози, протеїни та пептиди, циклодекстрини,
використовуються для поділу енантіомерів (хіральна хроматогра-
Сорбенти з щепленими фазами можуть мати різний ступінь хімі-
чеської модифікації. Частинки сорбенту можуть мати сферичну або не-
правильну форму та різноманітну пористість.
Як щеплені фази найчастіше застосовуються:
– октильні групи(сорбент октилсилан або С8);
– октадецільні групи(Сорбент октадецилсилан
(ODS) або С18);
– фенільні групи(Сорбент фенілсилан);
– ціанопропільні групи(Сорбент CN);
– амінопропильні групи(сорбент NH2);
- Діольні групи (сорбент діол).
Найчастіше аналіз виконують на неполярних щеплених фазах
звернено-фазовому режимі із застосуванням сорбенту С18 .
У деяких випадках доцільніше застосовувати нормально-
фазову хроматографію При цьому використовують силікагель або полярні щеплені фази (CN, NH2, діол) в поєднанні з неполярними розчинами.
Сорбенти з щепленими фазами хімічно стійкі при значеннях pH від 2,0 до 8,0, якщо інше не обумовлюється виробником.
Частинки сорбенту можуть мати сферичну або неправильну форму та різноманітну пористість. Розмір часток сорбенту в аналітичній ВЕРХ зазвичай становить 3–10 мкм, у препаративній ВЕРХ – до 50 мкм і більше.
Використовуються також монолітні сорбенти.
Висока ефективність поділу забезпечується високою площею поверхні частинок сорбенту (яка є наслідком їх мікроскопії.
чних розмірів та наявності пір), а також рівномірністю складу сорбенту і щільною та рівномірною його упаковкою.
Детектори
Використовуються різні способи детектування. У загальному випадку ПФ з розчиненими в ній компонентами після хроматографічної колон-
ки потрапляє в комірку детектора, де безперервно вимірюється та чи інша її властивість (поглинання в УФ або видимій області спектру, флуоресценція,
показник заломлення, електропровідність та ін.). Отримана при цьому хроматограма являє собою графік залежності деякого фізичного характеру.
ського чи фізико-хімічного параметра ПФ від часу.
Найбільш поширеними є спектрофотометричні де-
тектори (включаючи діодно-матричні), що реєструють зміну опти-
ської щільності в ультрафіолетовій, видимій і часто в ближній інфрачервоній
ній областях спектру від 190 до 800 або 900 нм. Хроматограма в цьому слу-
чає є залежність оптичної щільності ПФ від часу.
Традиційно використовуваний спектрофотометричний детектор дозволяє
ляє проводити детектування при будь-якій довжині хвилі в його робочому діапі-
зоні. Застосовуються також мультихвильові детектори, що дозволяють прово-
діти детектування за кількох довжинах хвиль одночасно.
За допомогою діодно-матричного детектора можна не тільки проводити детектування відразу по кількох довжинах хвиль, а й практично миттєво
венно (без сканування) отримувати оптичний спектр ПФ в будь-який момент часу, що значно спрощує якісний аналіз ком-
понентів.
Чутливість флуоресцентних детекторів приблизно в 1000 разів вища за чутливість спектрофотометричних. При цьому використовується або власна флуоресценція, або флуоресценція відповідних похідних, якщо сама речовина не флуоресціює. Сучасні-
менні флуоресцентні детектори дозволяють не тільки отримувати хромато-
грами, але і реєструвати спектри збудження та флуоресценції аналі-
зованих сполук.
Для аналізу зразків, що не поглинають в УФ та видимих областях спектру (наприклад, вуглеводів), використовують рефрактометричні детектори
(Рефрактометри). Недоліки цих детекторів – їх низька (порівняно зі спектрофотометричними детекторами) чутливість та значна температурна залежність інтенсивності сигналу (детектор необхідно термостатувати).
Використовуються також електрохімічні детектори (кондуктометричні
ські, амперометричні та ін), мас-спектрометричні та Фур'є-ІК-
детектори, детектори світлорозсіювання, радіоактивності та деякі інші
Рухома фаза
У Як ПФ можуть застосовуватися різноманітні розчинники - як індивідуальні, так і їх суміші.
У нормально-фазовийхроматографії зазвичай застосовуються рідкі уг-
лівороди (гексан, циклогексан, гептан) та інші відносно неполярні
розчинники з невеликими добавками полярних органічних сполук,
які регулюють елюювальну силу ПФ.
У звернено-фазовій хроматографії до складу ПФ входять полярні ор-
ганічні розчинники (зазвичай ацетонітрил та метанол) та вода. Для опти-
мізації поділу часто використовують водні розчини з певним зна-
ченням рН, зокрема буферні розчини. Застосовують добавки неоргані-
тичних та органічних кислот, основ і солей та інші сполуки (на-
приклад, хіральні модифікатори для поділу енантіомерів на ахіраль-
ном сорбенті).
Контроль значення рН необхідно здійснювати окремо для водного компоненту, а не для його суміші з органічним розчинником.
ПФ може складатися з одного розчинника, часто з двох, при необхо-
димості – із трьох і більше. Склад ПФ вказують як об'ємне співвідношення розчинників, що входять до неї. В окремих випадках може вказуватися мас-
сове співвідношення, що має бути спеціально обумовлено.
При використанні ультрафіолетового спектрофотометричного детектора ПФ не повинна мати вираженого поглинання при вибраній для детектування довжині хвилі. Межа прозорості або оптична щільність при визна-
ної довжині хвилі розчинника конкретного виробника часто вказують
ється на упаковці.
На хроматографічний аналіз великий вплив надає ступінь чистоти ПФ, тому переважно застосовувати розчинники,
ні спеціально для рідинної хроматографії (включаючи воду).
ПФ і аналізовані розчини не повинні містити нерозчинних-
ся частинок та бульбашок газу. Воду, одержану в лабораторних умовах,
водні розчини, попередньо змішані з водою органічні розчини.
рітелі, а також аналізовані розчини необхідно піддавати тонкій фільтрації та дегазації. Для цих цілей зазвичай застосовують фільтрування
під вакуумом через інертний по відношенню до даного розчинника або розчину мембранний фільтр з розміром пор 0,45 мкм.
Система збору та обробки даних
Сучасна система обробки даних являє собою сполуч-
дружинний з хроматографом персональний комп'ютер із встановленим про-
грамним забезпеченням, що дозволяє реєструвати та обробляти хро-
матограму, а також керувати роботою хроматографа і стежити за основною
ними параметрами хроматографічної системи.
Перелік умов хроматографування, що підлягають вказівці
У приватній фармакопейній статті мають бути наведені розміри ко-
лонки, тип сорбенту із зазначенням розміру частинок, температура колонки (якщо необхідно термостатування), обсяг проби, що вводиться (обсяг петлі), со-
ставши ПФ і спосіб її приготування, швидкість подачі ПФ, детектор і умови детектування, опис градієнтного режиму (якщо використовується), час хроматографування.
ІОНООБМІННА ТА ІОННА ВЕРХ
Іонообмінна хроматографія використовується для аналізу як органічно-
ських (гетероциклічні основи, амінокислоти, білки та ін), так і неор-
ганічних (різні катіони та аніони) сполук. Поділ компо-
нентов аналізованої суміші в іонообмінній хроматографії засновано на оборотній взаємодії іонів аналізованих речовин з іонними групами.
пами сорбенту. Як сорбенти використовуються аніоніти або катіоні-
ти. Ці сорбенти є, в основному, або полімерні іоно-
обмінні смоли (зазвичай кополімери стиролу та дивінілбензолу з приві-
іонними групами), або силікагелі з щепленими іонообмінними групами. Сорбенти із групами -(СН2 )3 N+ Х– використовуються для поділу аніонів, а сорбенти із групами -(СН2 )SО3 – Н+ – для поділу катіонів.
Зазвичай для поділу аніонів застосовують полімерні смоли, а для розд -
лення катіонів - модифіковані силікагелі.
Як ПФ в іонообмінній хроматографії застосовують водні розчини кислот, основ та солей. Зазвичай використовуються буферні рас-
твори, що дозволяють підтримувати певні значення рН. Можливе також використання невеликих добавок, що змішуються з водою органічно.
ських розчинників - ацетонітрилу, метанолу, етанолу, тетрагідрофурану.
Іонна хроматографія- варіант іонообмінної хроматографії,
якому для визначення концентрації іонів аналізованої речовини ви-
користується кондуктометричний детектор. Для високочутливого оп-
редіння змін електропровідності проходить через детектор ПФ фонова електропровідність ПФ повинна бути низькою.
Існують два основні варіанти іонної хроматографії.
Перший з них заснований на придушенні електропровідності електролі-
та ПФ за допомогою другої іонообмінної колонки, що знаходиться між ана-
літичною колонкою та детектором. У цій колонці відбувається нейтраліз-
ція ПФ і аналізовані сполуки потрапляють в комірку детектора в деіоні-
ній воді. Детектовані іони є єдиними іонами,
що забезпечують провідність ПФ. Недолік переважної колонки – необхідність її регенерації через досить короткі проміжки часу.
Мені. Переважна колонка може бути замінена безперервно дію-
щим мембранним подавлювачем, в якому склад мембрани безперервно про-
новлюється потоком регенеруючого розчину, що рухається в напрямку,
протилежному напрямку потоку ПФ.
Другий варіант іонної хроматографії - одноколоночна іонна хроматографія.
матографія. У цьому варіанті використовується ПФ з дуже низькою електропро-
водністю. В якості електролітів широко застосовують слабкі органічні
ські кислоти - бензойну, саліцилову або ізофталеву.
ЕКСКЛЮЗІЙНА ВЕРХ
Ексклюзивна хроматографія (гель-хроматографія) - особливий варіант ВЕРХ, заснований на розподілі молекул за їх розмірами. Розподіл
молекул між нерухомою та рухомою фазами засновано на розмірах мо-
лекул та частково на їх формі та полярності. Для поділу використовують по-
ристі сорбенти – полімери, силікагель, пористі стекла та полісахариди.
Розмір частинок сорбентів 5-10 мкм.
Перевагами пористого скла та силікагелю є швидка дифузія ПФ та молекул аналізованої речовини в пори, стійкість у різних умовах (навіть за високих температур). Полімерні сорбен-
ти є сополімерами стиролу і дивінілбензолу (це гідро-
фобні сорбенти, що використовуються з неполярними рухомими фазами) та
гідрофільні гелі, одержувані із сульфованого дивінілбензолу або поліакриламідних смол.
Можливі два граничні типи взаємодії молекул з пористою нерухомою фазою. Молекули, розмір яких більший за середній діаметр а пор, взагалі не проникають в сорбент і елююються разом з рухомою фа-
зою першими. Молекули з діаметром значно менше розміру пор сміття.
бента вільно проникають у нього, залишаються у нерухомій фазі найбільший час і елююються останніми. Молекули середніх розмірів проникають у пори сорбенту в залежності від розміру та частково в залежності від своєї форми. Вони елююються з різними часами утримування між са-
ними великими і найдрібнішими молекулами. Поділ компонентів хроматографованого зразка відбувається в результаті повторюваних ак-
тов дифузії компонентів зразка в пори сорбенту, і назад.
В эксклюзивної хроматографії для характеристики утримування вико-
користується обсяг утримування, що дорівнює добутку швидкості потоку ПФ на час утримування.
Рухлива фаза. Вибір ПФ залежить від типу сорбенту. Ексклюзив-
ная хроматографія в цілому ділиться на гель-фільтраційну та гель-
проникаючу хроматографію.
Метод гель-фільтраційної хроматографії використовують для розділу
ня водорозчинних сполук на гідрофільних сорбентах. Рухливі фази є водні буферні розчини із заданим значенням рН.
У гель-проникаючій хроматографії застосовуються гідрофобні сор-
бенти та неполярні органічні розчинники (толуол, дихлорметан, тет-
рагідрофуран). Цей метод використовують для аналізу сполук, малорос-
римих у воді.
детектори. В якості детекторів в хроматографії ексклюзійної використовуються диференціальні рефрактометричні детектори, а також спектрофотометричні детектори (в тому числі, в ІЧ-області спектру).
Застосовуються також віскозиметричний та проточний лазерний детектори.
Ці детектори в комбінації з рефрактометром або іншим концентра-
ним детектором дозволяють безперервно визначати молекулярну масупо-
лімеру в ПФ.
УЛЬТРАЕФЕКТИВНА РІДИНА ХРОМАТОГРАФІЯ
Ультраефективна рідинна хроматографія являє собою варіант рідинної хроматографії, що відрізняється більшою ефективно-
ністю порівняно з класичною ВЕРХ.
Особливістю ультраефективної рідинної хроматографії є
ся використання сорбентів з розміром частинок від 1,5 до 2 мкм. Розміри хро-
матографічних колонок зазвичай становлять від 50 до 150 мм у довжину та від 1
до 4 мм у діаметрі. Об'єм проби, що вводиться, може становити від 1 до 50 мкл.
Хроматографічне обладнання, що використовується в класичному ва-
ріанте ВЕРХ, зазвичай спеціально адаптовано для цього виду хроматогра-
Устаткування, призначене для ультраефективної рідинної хроматографії, може використовуватися і в класичному варіанті ВЕРХ.
ЗАГАЛЬНА ФАРМАКОПЕЙНА СТАТТЯ
Натомість ст. ДФ XI
Високоефективна рідинна хроматографія (рідинна хроматографія високого тиску) – це метод колонкової хроматографії, в якому рухомою фазою служить рідина, що рухається через хроматографічну колонку, заповнену нерухомою фазою (сорбентом). Колонки високоефективної рідинної хроматографії характеризуються високим гідравлічним опором на вході.
Залежно від механізму поділу речовин розрізняють наступні варіанти високоефективної рідинної хроматографії: адсорбційну, розподільчу, іонообмінну, екслюзійну, хіральну та ін. відповідно до характеру основних міжмолекулярних взаємодій, що проявляються. В адсорбційній хроматографії поділ речовин відбувається за рахунок їх різної здатності адсорбуватися та десорбуватися з поверхні сорбенту з розвиненою поверхнею, наприклад, силікагелю. У розподільчій високоефективній рідинній хроматографії поділ відбувається за рахунок відмінності коефіцієнтів розподілу речовин, що розділяються між нерухомою (як правило, хімічно прищепленою до поверхні нерухомого носія) і рухомою фазами.
Залежно від типу рухомої та нерухомої фази розрізняють нормально-фазову та обернено-фазову хроматографію. У нормально-фазовій високоефективної рідинної хроматографії нерухома фаза - полярна (найчастіше силікагель або силікагель з щепленими NH 2 - або CN-групами та ін), а рухлива фаза - неполярна (гексан, або суміші гексану з більш полярними органічними розчинниками - хлороформом, спиртами і т.д.). Утримування речовин зростає зі збільшенням їхньої полярності. У нормально-фазовій хроматографії елюююча здатність рухомої фази збільшується зі зростанням її полярності.
У обернено-фазовій хроматографії нерухома фаза – неполярна (гідрофобні силікагелі з щепленими групами С4, С8, С18 та ін.); рухлива фаза – полярна (суміші води та полярних розчинників: ацетонітрилу, метанолу, тетрагідрофурану та ін.). Утримування речовин зростає зі збільшенням їхньої гідрофобності (неполярності). Чим більший вміст органічного розчинника, тим вище елюююча здатність рухомої фази.
В іонообмінній хроматографії молекули речовин суміші, дисоційовані в розчині на катіони та аніони, поділяються при русі через сорбент (катіоніт або аніоніт) за рахунок різної сили взаємодії іонів, що визначаються з іонними групами сорбенту.
В екслюзійній (ситової, гель-проникаючої, гель-фільтраційної) хроматографії молекули речовин поділяються за розміром за рахунок їх різної здатності проникати в пори нерухомої фази. При цьому першими з колонки виходять найбільші молекули, здатні проникати в мінімальне число пір нерухомої фази, а останніми виходять речовини з малими розмірами молекул.
У хіральній хроматографії відбувається розподіл оптично активних сполук на окремі енантіомери. Поділ може здійснюватися на хіральних нерухомих фазах або на ахіральних нерухомих фазах з використанням хіральних рухомих фаз.
Існують інші варіанти високоефективної рідинної хроматографії.
часто поділ протікає не по одному, а по кількох механізмах одночасно, залежно від типу рухомої та нерухомої фаз, а також природи з'єднання, що визначається.
Галузь застосування
Високоефективна рідинна хроматографія успішно застосовується як для якісного, так і для кількісного аналізу лікарських засобів у випробуваннях «Справжність», «Сторонні домішки», «Розчинення», «Однорідність дозування», «Кількісне визначення». Слід зазначити, що хроматографія дозволяє поєднувати в одній пробі кілька випробувань, у тому числі «Справжність» та «Кількісне визначення».
Устаткування
Для аналізу використовують відповідні прилади – рідинні хроматографи.
До складу рідинного хроматографа зазвичай входять такі основні вузли:
- вузол підготовки рухомої фази, включаючи ємність з рухомою фазою (або ємності з окремими розчинниками, що входять до складу рухомої фази) та систему дегазації рухомої фази;
- Насосна система;
- Змішувач рухомої фази (при необхідності);
- Система введення проби (інжектор) може бути ручним або автоматичним (автосамплер);
- хроматографічна колонка (може бути встановлена в термостаті);
- детектор (один або кілька з різними способами детектування);
- Система управління хроматографом, збору та обробки даних.
Крім цього до складу хроматографа можуть входити: система пробопідготовки та передколонковий реактор, система перемикання колонок, постколоночний реактор та інше обладнання.
Насосна система
Насоси забезпечують подачу рухомої фази в колонку із заданою швидкістю. Склад рухомої фази та швидкість потоку можуть бути постійними або змінними під час аналізу. У разі постійного складу рухомої фази процес називають ізократичним, тоді як у другому – градієнтним. Сучасна насосна система хроматографа рідинного складається з одного або декількох насосів, керованих комп'ютером. Це дозволяє змінювати склад рухомої фази за певною програмою при градієнтному елююванні. Насоси для високоефективної аналітичної рідинної хроматографії дозволяють підтримувати швидкість подачі рухомої фази в колонку в інтервалі від 0,1 до 10 мл/хв при тиску на вході в колонку до 40 МПа. Пульсації тиску мінімізуються спеціальними демпферними системами, що входять до конструкції насосів. Робочі деталі насосів виготовляються із корозійностійких матеріалів, що дозволяє використовувати у складі рухомої фази агресивні компоненти.
Змішувачі
У змішувачі відбувається утворення єдиної рухомої фази з окремих розчинників, що подаються насосами, якщо необхідна суміш була приготовлена заздалегідь. Змішування компонентів рухомої фази в змішувачі може відбуватися як при низькому тиску (до насосів), так і високому тиску (після насосів). Змішувач можна використовувати для підготовки рухомої фази та при ізократичному елююванні.
Об'єм змішувача може впливати на час утримування компонентів при градієнтному елююванні.
Інжектори
Інжектори можуть бути універсальними, з можливістю зміни обсягу проби, що вводиться, або дискретними для введення проби тільки певного обсягу. Обидва типи інжекторів можуть бути автоматичними (автоінжектори або автосемплери). Інжектор для введення проби (розчину) розташований безпосередньо перед колонкою хроматографії. Конструкція інжектора дозволяє змінювати напрямок потоку рухомої фази і здійснювати попереднє введення проби в петлю-дозатор певного об'єму (зазвичай від 10 до 100 мкл) або спеціальний пристрій змінного об'єму. Об'єм петлі вказаний на її маркуванні. Конструкція дискретного інжектора, зазвичай, дозволяє здійснювати заміну петлі. Сучасні автоматичні інжектори можуть мати поруч додаткових функцій, наприклад, виконувати функцію станції пробопідготовки: здійснювати змішання та розведення зразків, проводити реакцію передколонкової дериватизації.
Хроматографічна колонка
Хроматографічні колонки зазвичай є трубками з нержавіючої сталі, скла або пластику, заповнені сорбентом і закриті з обох сторін фільтрами з діаметром пор 2-5 мкм. Довжина аналітичної колонки може бути в діапазоні від 5 до 60 см і більше, внутрішній діаметр - від 2 до 10 мм. Колонки з внутрішнім діаметром менше 2 мм використовуються в мікроколонній хроматографії. Існують також капілярні колонки із внутрішнім діаметром близько 0,3–0,7 мм. Колонки для препаративної хроматографії можуть мати внутрішній діаметр 50 мм та більше.
Перед аналітичною колонкою можуть встановлюватися короткі колонки (передколонки), що виконують різні допоміжні функції, основна з яких є захист аналітичної колонки. Зазвичай аналіз проводять при кімнатній температурі, проте для підвищення ефективності поділу та скорочення тривалості аналізу може бути використане термостатування колонок при температурах до 80 – 100 °С. Можливість використання підвищеної температури при розподілі обмежується стабільністю нерухомої фази, оскільки при підвищених температурах можлива її деструкція.
Нерухома фаза (сорбент)
Як сорбенти зазвичай застосовуються:
- силікагель, оксид алюмінію, використовуються у нормально-фазовій хроматографії. Механізм утримування у разі – зазвичай адсорбція;
- силікагель, смоли або полімери з щепленими кислотними чи основними групами. Область застосування – іонообмінна та іонна хроматографія;
- силікагель або полімери із заданим розподілом розмірів пор (ексклюзивна хроматографія);
- хімічно модифіковані сорбенти (сорбенти з щепленими фазами), приготовані найчастіше на основі силікагелю. Механізм утримування - адсорбція або розподіл між рухомою та нерухомою фазами. Область застосування залежить від типу щеплених функціональних груп. Деякі типи сорбентів можуть використовуватися як у зверненій, так і нормально фазової хроматографії;
- хімічно модифіковані хіральні сорбенти, наприклад, похідні целюлози та амілози, протеїни та пептиди, циклодекстрини, хітозани, що використовуються для поділу енантіомерів (хіральна хроматографія).
Сорбенти з щепленими фазами можуть мати різний ступінь хімічної модифікації. Як щеплені фази найчастіше застосовуються:
– октадецильні групи (сорбент октадецилсилан (ODS) або С18);
- октильні групи (сорбент октилсилан або С8);
- фенільні групи (сорбент фенілсілан);
- ціанопропільні групи (сорбент CN);
– амінопропильні групи (сорбент NH2);
- Діольні групи (сорбент діол).
Найчастіше аналіз виконують на неполярних щеплених фазах в обернено-фазовому режимі із застосуванням сорбенту 18 .
Сорбенти з щепленими фазами, отримані на основі силікагелю, хімічно стійкі при значеннях pH від 2,0 до 7,0, якщо інше не обумовлюється виробником. Частинки сорбенту можуть мати сферичну або неправильну форму та різноманітну пористість. Розмір часток сорбенту в аналітичній високоефективній рідинній хроматографії зазвичай становить 3-10 мкм, у препаративній високоефективній рідинній хроматографії - 50 мкм і більше. Існують також монолітні колонки, в яких сорбент є монолітом з наскрізними порами, що заповнює весь обсяг колонки.
Висока ефективність поділу забезпечується високою площею поверхні частинок сорбенту (яка є наслідком їх мікроскопічних розмірів та наявності пір), а також рівномірністю складу сорбенту та щільною та рівномірною його упаковкою.
Детектори
У високоефективної рідинної хроматографії використовують різні способи детектування. У загальному випадку рухлива фаза з розчиненими в ній компонентами після хроматографічної колонки потрапляє в комірку детектора, де безперервно вимірюється та чи інша її властивість (поглинання в ультрафіолетовій або видимій ділянці спектра, флуоресценція, показник заломлення, електропровідність та ін.). Отримана при цьому хроматограма є графіком залежності деякого фізичного або фізико-хімічного параметра рухомої фази від часу.
Найбільш поширеними детекторами високоефективної рідинної хроматографії є спектрофотометричні. У процесі елюювання речовин у спеціально сконструйованій мікрокюветі вимірюється оптична щільність елюату при заздалегідь вибраній довжині хвилі. Широка область лінійності детектора дозволяє аналізувати як домішки, і основні компоненти суміші однією хроматограмме. Спектрофотометричний детектор дозволяє проводити детектування за будь-якої довжини хвилі в його робочому діапазоні (як правило, 190-600 нм). Застосовуються також мультихвильові детектори, що дозволяють проводити детектування за декількох довжин хвиль одночасно і детектори на діодній матриці, що дозволяють реєструвати оптичну щільність одночасно у всьому робочому діапазоні довжин хвиль (як правило, 190-950 нм). Це дозволяє реєструвати спектри поглинання компонентів, що проходять через комірку детектора.
Флуориметричний детектор застосовується для визначення флуоресціюючих сполук або не флуоресціюючих сполук у вигляді їх флуоресціюючих похідних. Принцип дії флуориметричного детектора ґрунтується на вимірі флуоресцентного випромінювання поглиненого світла. Поглинання зазвичай проводять в ультрафіолетовій ділянці спектру, довжини хвиль флуоресцентного випромінювання перевищують довжини хвиль поглиненого світла. Флуориметричні детектори мають дуже високу чутливість і селективність. Чутливість флуоресцентних детекторів приблизно в 1000 разів вища за чутливість спектрофотометричних. Сучасні флуоресцентні детектори дозволяють не лише отримувати хроматограми, а й реєструвати спектри збудження та флуоресценції аналізованих сполук.
Для визначення сполук, що слабо поглинають в ультрафіолетовій та видимій областях спектру (наприклад вуглеводів), використовують рефрактометричнідетектори (рефрактометри). Недоліки цих детекторів – їх низька (порівняно зі спектрофотометричними детекторами) чутливість та значна температурна залежність інтенсивності сигналу (детектор необхідно термостатувати), а також неможливість їх використання у режимі градієнтного елюювання.
Принцип роботи випарних детекторів лазерного світлового розсіюваннязаснований на відмінності тисків парів хроматографічних розчинників, що входять до складу рухомої фази, та аналізованих речовин. Рухлива фаза на виході з колонки вводиться в розпилювач, змішується з азотом або 2 і у вигляді дрібнодисперсного аерозолю потрапляє в обігрівається випарну трубку з температурою 30 - 160 ° С, в якій рухома фаза випаровується. Аерозоль з нелетких частинок аналізованих речовин розсіює світловий потік камери розсіювання. За ступенем розсіювання світлового потоку можна судити про кількість з'єднання, що визначається. Детектор чутливіший, ніж рефрактометричний, його сигнал не залежить від оптичних властивостей проби, від типу функціональних груп у визначених речовинах, від складу рухомої фази і може бути використаний у режимі градієнтного елюювання.
Електрохімічні детектори (кондуктометричні, амперометричні, кулонометричні та ін.). Амперометричний детектор застосовують визначення електроактивних сполук, які можуть бути окислені або відновлені на поверхні твердого електрода. Аналітичним сигналом є величина струму окислення чи відновлення. У осередку детектора є принаймні два електроди - робочий і електрод порівняння (хлоридсрібний або сталевий). До електродів прикладається робочий потенціал, величина якого залежить від природи з'єднань, що визначаються. Вимірювання можуть проводитися як при постійному потенціалі, так і в імпульсному режимі, коли визначається профіль зміни потенціалу робочого електрода протягом одного циклу реєстрації сигналу. В амперометрическом детекторі використовують робочі електроди з вуглецевих матеріалів (найчастіше скловуглецевий або графітовий), та металеві: платиновий, золотий, мідний, нікелевий.
Кондуктометричний детектор використовують для детектування аніонів та катіонів в іонній хроматографії. Принцип його роботи заснований на вимірі електропровідності рухомої фази у процесі елюювання речовини.
Винятково інформативним є мас-спектрометричний детектор, який має високу чутливість і селективність. Останні моделі мас-спектрометрів для рідинної хроматографії працюють у діапазоні мас m/z від 20 до 4000 а.
У високоефективній рідинній хроматографії використовуються також Фур'є-ІЧ-детектори, радіоактивності та деякі інші.
Система збору та обробки даних
Сучасна система обробки даних являє собою пов'язаний з хроматографом персональний комп'ютер із встановленим програмним забезпеченням, що дозволяє реєструвати та обробляти хроматограму, а також керувати роботою хроматографа та стежити за основними параметрами хроматографічної системи.
Рухома фаза
Рухлива фаза високоефективної рідинної хроматографії виконує двояку функцію: забезпечує перенесення десорбованих молекул по колонці і регулює константи рівноваги, а, отже, і утримання в результаті взаємодії з нерухомою фазою (сорбуючись на поверхні) і з молекулами речовин, що розділяються. Таким чином, змінюючи склад рухомої фази високоефективної рідинної хроматографії можна впливати на часи утримування сполук, селективність і ефективність їх поділу.
Рухома фаза може складатися з одного розчинника, часто з двох, при необхідності - з трьох і більше. Склад рухомий фази вказують як об'ємне співвідношення розчинників, що входять до неї. В окремих випадках може вказуватись масове співвідношення, що має бути спеціально обумовлено. Як компоненти рухомої фази можуть бути використані буферні розчини з певним значенням рН, різні солі, кислоти і основи та інші модифікатори.
У нормально-фазовій хроматографії зазвичай застосовуються рідкі вуглеводні (гексан, циклогексан, гептан) та інші відносно неполярні розчинники з невеликими добавками органічних полярних сполук, які регулюють елюювальну силу рухомої фази.
У звернено-фазовій хроматографії як рухому фазу використовується вода або водно-органічні суміші. Органічними добавками зазвичай є полярні органічні розчинники (ацетонітрил і метанол). Для оптимізації поділу можуть використовуватися водні розчини з певним значенням рН, зокрема буферні розчини, а також різні добавки в рухому фазу: фосфорна та оцтова кислоти при розділенні сполук кислотного характеру; аміак та аліфатичні аміни при поділі сполук основного характеру та інші модифікатори.
На хроматографічний аналіз великий вплив має ступінь чистоти рухомої фази, тому переважно застосовувати розчинники, випущені спеціально для рідинної хроматографії (включаючи воду).
При використанні УФ-спектрофотометричного детектора рухома фаза не повинна мати вираженого поглинання при вибраній для детектування довжині хвилі. Межа прозорості або оптична щільність за певної довжини хвилі розчинника конкретного виробника часто вказується на упаковці.
Рухлива фаза і аналізовані розчини не повинні містити частинок, що не розчинилися, і бульбашки газу. Воду, отриману в лабораторних умовах, водні розчини, попередньо змішані з водою органічні розчинники, а також аналізовані розчини необхідно тонкої фільтрації і дегазації. Для цих цілей зазвичай застосовують фільтрування під вакуумом через інертний по відношенню до даного розчинника або розчину мембранний фільтр з розміром пор 0,45 мкм
Перелік умов хроматографування, що підлягають вказівці
У фармакопейній статті повинні бути наведені: повне комерційне найменування колонки із зазначенням виробника та каталожного номера, розміри колонки (довжина та внутрішній діаметр), типу сорбенту із зазначенням розміру частинок, розміру пір, температура колонки (якщо необхідне термостатування), обсяг проби, що вводиться (обсяг) петлі), склад рухомої фази і спосіб її приготування, швидкість подачі рухомої фази, тип детектора та умови детектування (при необхідності параметри комірки детектора, що використовується), опис градієнтного режиму (якщо використовується), що включає в себе стадію перерівноваження до вихідних умов, час хроматографування, докладний описметодики та формули розрахунку, описи приготування стандартних та випробуваних розчинів.
У разі використання передколонної дериватизації в автосамплері наводиться інформація про програму роботи автосамплера. У разі використання постколонової дериватизації вказується швидкість подачі дериватизуючого реагенту, обсяг петлі змішування та її температура.
Модифіковані види високоефективної рідинної хроматографії
Іон-парна хроматографія
Одним із різновидів звернено-фазової високоефективної рідинної хроматографії є іон парна хроматографія – що дозволяє визначати іонізовані сполуки. Для цього до складу традиційної звернено-фазової високоефективної рідинної хроматографії рухомої фази додають органічні гідрофобні сполуки з іоногенними групами (іон парні реагенти). Для поділу основ зазвичай використовують алкілсульфати натрію, для поділу кислот застосовують солі тетраалкіламонію (тетрабутиламонію фосфат, цетилтриметиламонію бромід та ін). В іон-парному режимі селективність поділу неіоногенних компонентів буде лімітуватися звернено-фазовим механізмом утримування, а утримання основ і кислот помітно зростає, при цьому покращується форма хроматографічних піків.
Утримання в іон-парному режимі обумовлено досить складними рівноважними процесами, що конкурують між собою. З одного боку, за рахунок гідрофобних взаємодій та ефекту витіснення полярного середовища рухомої фази можлива сорбція гідрофобних іонів на поверхні алкілсилікагелю таким чином, що заряджені групи звернені до рухомої фази. У цьому випадку поверхня набуває іонообмінних властивостей, і утримування підпорядковується закономірностям іонообмінної хроматографії. З іншого боку, можливе утворення іонної пари безпосередньо в об'ємі елюентів, з подальшою її сорбцією на сорбенті по звернено-фазовому механізму.
Хроматографія гідрофільного взаємодії ( HILIC хроматографія)
Хроматографія гідрофільного взаємодії використовується для поділу полярних сполук, що слабо утримуються в обернено-фазовій високоефективній рідинній хроматографії. Як рухомий фази в цьому варіанті хроматографії використовуються водно-ацетонітрильні суміші з додаванням солей, кислот або основ. Нерухомими фазами, як правило, є силікагелі, модифіковані полярними групами (аміно-, діольні, ціанопропільні групи тощо). Більше полярні з'єднання утримуються сильніше. Елюююча здатність рухомої фази зростає зі збільшенням полярності.
Іонообмінна та іонна високоефективна рідинна хроматографія
Іонообмінна хроматографія використовується для аналізу як органічних (гетероциклічні основи, амінокислоти, білки та ін.), так і неорганічних (різні катіони та аніони) сполук. Поділ компонентів аналізованої суміші в іонообмінній хроматографії заснований на оборотній взаємодії іонів аналізованих речовин з іонообмінними групами сорбенту. Ці сорбенти являють собою, переважно, або полімерні іонообмінні смоли (зазвичай кополімери стиролу і дивінілбензолу з щепленими іонообмінними групами), або силікагелі з щепленими іонообмінними групами. Сорбенти з групами: -NH 3 + , -R 3 N + , -R 2 HN + , -RH 2 N + та ін. – , –СООН, -PО 3 – та інших. поділу катіонів (катіоніти).
В якості рухомої фази в іонообмінній хроматографії застосовують водні розчини кислот, основ та солей. Зазвичай використовують буферні розчини, що дають змогу підтримувати певні значення рН. Можливе також використання невеликих добавок органічних розчинників, що змішуються з водою – ацетонітрилу, метанолу, етанолу, тетрагідрофурану.
Іонна хроматографія - варіант іонообмінної хроматографії, в якому для детектування з'єднань (іонів), що визначаються, використовується кондуктометричний детектор. Для високочутливого визначення змін електропровідності рухомої фази, що проходить через детектор, фонова електропровідність рухомої фази повинна бути низькою.
Існують два основні варіанти іонної хроматографії.
Перший - двоколоночная іонна хроматографія, заснований на придушенні електропровідності електроліту рухомий фази з допомогою другий іонообмінної колонки або спеціальної мембранної системи придушення, що знаходиться між аналітичною колонкою і детектором. При проходженні через систему електропровідність рухомої фази знижується.
Другий варіант іонної хроматографії – одноколоночна іонна хроматографія. У цьому варіанті використовується рухома фаза з дуже низькою електропровідністю. Як електроліти широко застосовують слабкі органічні кислоти: бензойну, саліцилову або ізофталеву.
Ексклюзивна високоефективна рідинна хроматографія
Ексклюзивна хроматографія (гель-хроматографія) - особливий варіант високоефективної рідинної хроматографії, заснований на розподілі молекул за їх розмірами. Розподіл молекул між нерухомою та рухомою фазами заснований на розмірах молекул і частково на їх формі та полярності.
Можливі два граничні типи взаємодії молекул з пористою нерухомою фазою. Молекули з розмірами, що перевищують максимальний діаметр пір, взагалі не утримуються і елююються першими, переміщаючись одночасно з рухомою фазою. Молекули з розмірами, меншими ніж мінімальний діаметр пір сорбенту, вільно проникають у пори та елююються з колонки останніми. Інші молекули, що мають проміжні розміри, утримуються в порах частково і в ході елюювання поділяються на фракції відповідно до своїх розмірів і, частково, формою проникають у пори сорбенту в залежності від розміру та частково в залежності від своєї форми. В результаті речовини елююються з різними часами утримання.
Іоноексклюзивна хроматографія
В основі механіму іоноексклюзійної хроматографії лежить ефект, в результаті якого з'єднання в іонізованій формі не утримуються на сорбенті-іонообміннику, тоді як з'єднання в молекулярній формі розподіляються між нерухомою і водною фазами всередині пор іонообмінного сорбенту і рухомою фазою мігрує в просторі між. Поділ заснований на електростатичному відштовхуванні, полярних та гідрофобних взаємодіях між розчиненими сполуками та сорбентом.
Аніоногенні групи на поверхні сорбенту діють як напівпроникна «мембрана» між стаціонарною та рухомою фазами. Негативно заряджені компоненти не досягають стаціонарної рухомої фази, оскільки відштовхуються однойменно зарядженими функціональними групами і елююються в "мертвому" (вільному) об'ємі колонки. Компоненти в молекулярному вигляді не «відторгаються» катіонообмінним сорбентом і розподіляються між стаціонарною та рухомою фазами. Відмінність у мірі утримання неіонних компонентів суміші продиктована сукупністю полярних взаємодій неіонних компонентів з функціональними групами катіонообмінного сорбенту та гідрофобних взаємодій неіонних компонентів з неполярною матрицею сорбенту.
Хіральна хроматографія
Метою хіральної хроматографії є поділ оптичних ізомерів. Поділ здійснюється на хіральних нерухомих фазах або на звичайних ахіральних нерухомих фазах з використанням хіральних рухомих фаз. В якості хіральних нерухомих фаз використовуються сорбенти з модифікованою поверхнею, групами або речовинами, що мають хіральні центри (хітозани, циклодекстрини, полісахариди, білки та ін. (хіральні селектори). В якості рухомих фаз в цьому випадку можуть використовуватися ті ж фази, що і в При використанні ахіральних нерухомих фаз для забезпечення поділу енантіомерів в рухомі фази додаються хіральні модифікатори: хіральні комплекси металів, нейтральні хіральні ліганди, хіральні іон-парні реагенти та ін.
Ультраефективна рідинна хроматографія
Ультраефективна рідинна хроматографія є варіантом рідинної хроматографії, що відрізняється більшою ефективністю в порівнянні з класичною високоефективною рідинною хроматографією.
Особливістю ультраефективної рідинної хроматографії є використання сорбентів розміром частинок від 1,5 до 2 мкм. Розміри хроматографічних колонок зазвичай складають від 50 до 150 мм у довжину та від 1 до 4 мм у діаметрі. Об'єм проби, що вводиться, може становити від 1 до 50 мкл. Використання таких хроматографічних колонок дозволяє значно зменшити час аналізу та підвищити ефективність хроматографічного поділу. Однак, при цьому тиск на колонці може досягати 80-120 МПа, необхідна частота збору даних детектора може зростати до 40-100 герц, позаколоночний об'єм хроматографічної системи повинен бути мінімізований. Хроматографічне обладнання та колонки, що використовуються в ультраефективній рідинній хроматографії, спеціально адаптовані для виконання вимог цього виду хроматографії.
Устаткування, призначене для ультраефективної хроматографії рідинної, може використовуватися і в класичному варіанті високоефективної рідинної хроматографії.
Вступ
Хроматографічний аналіз є критерієм однорідності речовини: якщо будь-яким хроматографічним способом аналізована речовина не розділилася, його вважають однорідним (без домішок).
p align="justify"> Принциповою відмінністю хроматографічних методів від інших фізико-хімічних методів аналізу є можливість поділу близьких за властивостями речовин. Після поділу компоненти аналізованої суміші можна ідентифікувати (встановити природу) та кількісно визначати (масу, концентрацію) будь-якими хімічними, фізичними та фізико-хімічними методами.
Хроматографія широко застосовується в лабораторіях та в промисловості для якісного та кількісного аналізу багатокомпонентних систем, контролю виробництва, особливо у зв'язку з автоматизацією багатьох процесів, а також для препаративного (у тому числі промислового) виділення індивідуальних речовин (наприклад, шляхетних металів), поділу рідкісних та розсіяних елементів.
Відповідно до агрегатного стану елюентів розрізняють газову (ГХ, GC) і рідинну хроматографію (ВЕРХ, HPLC).
Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ, HPLC) використовується для аналізу, поділу та очищення синтетичних полімерів, лікарських препаратів, детергентів, білків, гормонів та ін біологічно важливих сполук. Використання високочутливих детекторів дозволяє працювати з дуже малими кількостями речовин (10 -11 -10 -9 г), що дуже важливо у біологічних дослідженнях.
Метод ВЕРХ складає різних рідинних хроматографах. Сучасні рідинні хроматографи призначені для поділу складних сумішей речовин на окремі компоненти та проведення якісного та кількісного аналізу компонентів суміші, що розділяється.
високоефективна рідинна хроматографія пропіфеназон
У зв'язку із запровадженням у практику фармацевтичного виробництва Росії GMP. підвищується значущість використання сучасних уніфікованих методів аналізу як на підприємствах-виробниках: так і в системі державного контролю якості лікарських засобів. Базовим методом аналізу якості субстанцій та готових лікарських засобів у країнах з розвиненою фармацевтичною промисловістю (США, Англія. Японія, країни ЄС) є високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ). Цей метод за своїми характеристиками відповідає вимогам кількісного аналізу близько 80-90% препаратів.
До техніки виконання будь-яких хроматографічних визначень пред'являються деякі Загальні вимоги. Насамперед, необхідно відзначити ті з них, які викликають у фахівців-початківців найбільше питань.
1. Кондиціювання приміщення. У приміщенні, де встановлюється рідинний хроматограф, повинно бути різких коливань температури.
Зміна температури може призвести до зміни утримування, ефективності і навіть селективності поділу.
У літню спеку в некондиціонованих приміщеннях дуже важко робота з нормально-фазовими легкокиплячими рухомими фазами. Протягом дня відбувається їхнє поступове випаровування, що призводить до зміни складу елюентів.
При знижених температурах виникають проблеми в роботі з елюентами, збагаченими водою та/або спирти, що містять. В'язкість таких елюентів різко зростає при зниженні температури, що призводить до підвищення тиску в системі.
Вплив невеликих коливань температури на поділ можна усунути термостатуючи хроматографічну колонку або всю рідинну систему (що можливо не для всіх хроматографів).
2. Якість електроживлення. Більшість сучасних хроматографів оснащені системами стабілізації живлення, проте якість електроживлення на місці також має бути високою. При недостатньому хорошому електроживленні будь-який запуск серії визначень в автоматичному режимі може скінчитися невдачею через збій.
3. Чистота розчинників. Для приготування рухомих фаз слід використовувати особливо чисті розчинники.
У загальному випадку, вимоги до чистоти рухомої фази залежать від способу детектування, методу елюювання (ізократичного або градієнтного), чутливості детектора до цільового аналіту та його концентрації.
При застосуванні УФ детектування вимоги до чистоти розчинників підвищуються при переході до короткохвильового діапазону менше 230-240 нм. Для ізократичного елюювання при УФ детектуванні на довжинах хвиль, більших за 220-240 нм, можна застосовувати розчинники марки "ос. ч." і воду-дистилят. Усі реагенти, що додаються в рухому фазу, також мають бути досить чистими; Кристалічні реагенти перед застосуванням буває корисно перекристалізувати.
Для градієнтного елюювання необхідно застосовувати розчинники марки "для рідинної хроматографії" ("for liquid chromatography") та воду-бідистилят. Особливі вимоги у методі градієнтного елюювання (в обернено-фазовій хроматографії) висуваються до чистоти водного буфера та води зокрема. Насамперед це пов'язано з тим, що на початковій стадії елюювання адсорбент поглинає зі збагаченої водним буфером рухомої фази забруднюючі компоненти, які надалі елююються і проявляються на хроматограмі у вигляді "горбів", "порогів" та окремих піків, що сильно ускладнюють виділення корисних сигналів аналітів. .
Найбільш чисті розчинники потрібні щодо групових визначень слідових кількостей речовин як градієнтного элюирования.
Для виконання визначень в градієнтному режимі елюювання, а також прецизійних визначень в ізократичному режимі рухлива фаза повинна застосовуватися одноразово, тобто елюат повинен скидатися або утилізуватися.
При ізократичному елююванні, якщо немає особливих проблем із чутливістю, відпрацьований елюент можна застосовувати повторно. Система, в якій елюат після проходження через детектор надходить назад у ємність із рухомою фазою, називається "системою з рециклом". Особливо корисною така система виявляється у разі проведення великої кількості рутинних ізократичних визначень на стандартних колонках (250х4.6, 150х4.6) за об'ємної швидкості близько 1 мл/хв. У таких випадках система з рециклом забезпечує економію до 200-300 мл органічного розчинника щодня. Така економна система дозволяє використовувати для аналізу дуже чисті, дорогі розчинники. Питання економії дорогих розчинників стоїть менш гостро у разі застосування мікроколонок (80х2, 100х2), оскільки для поділу потрібно на порядок менший об'єм рухомої фази.
4. Дегазація розчинників. Розчинники, які застосовуються у хроматографії для приготування рухомих фаз, зазвичай містять розчинене повітря. Особливо багато повітря містить воду.
Працюючи на недегазованих елюентах бульбашки повітря потрапляють у різні вузли рідинної системи: насос, колонку, капіляри, детектор. При попаданні повітря рідинну систему на хроматограмі з'являються високі періодичні шуми, викликані коливанням тиску рідинної системі. Це призводить до різкого зменшення чутливості до аналізу.
Для видалення повітря їх елюенти проводять його дегазацію. Як правило, дегазують тільки елюенти для обернено-фазових поділів - оскільки водноорганічні суміші містять значну кількість розчиненого повітря. Особливо ретельно дегазація повинна здійснюватись у разі градієнтного елюювання, а також при застосуванні флуориметричного детектування.
У ході градієнтного елюювання в обернено-фазовому режимі відбувається змішування двох елюентів - водноорганічних сумішей різного складу. Змішування недегазованих елюентів призводить до інтенсивного виділення розчиненого повітря, що критично для визначення в цілому (на хроматограмі бульбашки повітря реєструються у вигляді різких "викидів" на нульовій лінії).
Чутливість флуориметричного детектування зменшується при високому вмісті розчиненого повітря в рухомій фазі (відбувається гасіння флуоресценції). Таким чином, при застосуванні флуориметричного детектування дегазації елюентів слід приділяти особливу увагу.
Існує три основні способи дегазації рухомих фаз для рідинної хроматографії.
а. Дегазація вакуумом - елюенти витримують у колбі Кляйзена під вакуумом водоструминного насоса протягом декількох хвилин. Під час проведення дегазації слід уникати кипіння елюентів.
б. Термічна дегазація застосовується для дегазації водно-органічних елюентів з високою часткою води. Рухливу фазу поміщають у колбу, яку герметично не закривають пробкою, і залишають у водяній бані при температурі близько 50ºС. Через 10-15 хвилин колбу закривають пробкою герметично та охолоджують її під струменем води до кімнатної температури.
в. Дегазація ультразвуком. Рухливу фазу кілька хвилин обробляють ультразвуком, а потім дають їй відстоятись протягом 10-15 хвилин. Цей спосіб часто буває недостатньо ефективним для дегазації водноорганічних елюентів.
Сучасні насосні системи для хроматографії рідини комплектуються системами автоматичної дегазації. Проте, під час проведення градієнтних аналізів обидві рухливі фази краще дегазувати попередньо і " вручну " , за одним із наведених методів.
5. Фільтрування рухомої фази. Для забезпечення безперебійної роботи насоса рухливу фазу бажано фільтрувати під вакуумом із застосуванням мембранного фільтра.
6. Промивання колонки та вузлів рідинної системи. Після роботи з водноорганічними рухомими фазами, що містять солі та кислоти, всю рідинну систему (включаючи колонку) слід промити дистильованою водою з додаванням 5-10% органічного розчинника. Таке промивання робиться для того, щоб у неробочий час додатково не зношувалися вузли рідинної системи хроматографа та сама нерухома фаза.
Не проведення такого промивання призводить, перш за все, до того, що після зупинки насоса на деталях і стінках кювети детектора з елюентів осаджуються солі. Це, у свою чергу, призводить до нестійкої роботи приладу в цілому, а також передчасного зносу частин насоса, що рухаються. Регулярна відсутність промивання системи від солю і кислоти елюентів, що містять, може призвести до скорочення часу життя нерухомої фази.
Добавка до промивної води деякої кількості органічного розчинника необхідна для запобігання біологічному забруднюванню рідинної системи.
7. Перехід на нову рухливу фазу, яка не поєднується з попередньою. Такий перехід здійснюється через проміжний розчинник, що необмежено змішується з обома рухомими фазами - зазвичай, через ізопропанол або ацетон.
Для переходу з водного елюенту на неполярний елюент рідинну систему слід промити водою з добавкою органічного розчинника, потім зняти хроматографічну колонку, промити систему ізопропанолом (ацетоном), промити систему неполярним елюентом, встановити нову колонку.
Для зворотного переходу знімають хроматографічну колонку, промивають рідинну систему ізопропанолом (ацетоном), водним елюентом, потім ставлять нову колонку.
При переході від водного елюенту до неполярного слід заздалегідь переконатись, що матеріал ущільнень насоса розрахований на роботу з неполярними розчинниками.
8. Фільтрування проби. Якщо аналізована проба містить нерозчинену завись, її бажано відфільтровувати, пропускаючи пробу через мембранний фільтр, з'єднаний зі шприцом. На жаль, якщо проби мало, менше мілілітра, то профільтрувати її у такий спосіб стає практично неможливо.
При регулярному аналізі проб, що містять суспензії, вхідний фільтр на колонці (фріт) може засмічитися, що призведе насамперед до збільшення тиску в системі. В цьому випадку вхідний фільтр краще замінити, а за відсутності заміни - промити його в органічному розчиннику з обробкою ультразвуком протягом 10-15 хвилин.
Найбільш оптимальним вирішенням проблеми є застосування інлайн фільтра перед колонкою. Ін-лайн фільтр містить змінний фрит - такий самий, як і на колонці. Заміна фриту на інлайн фільтрі є рутинною операцією, яка може проводитися досить часто.
9. Застосування передколонок. При регулярному аналізі "брудних" проб хроматографічна колонка досить швидко забруднюється та втрачає свою роздільну здатність. Відомою альтернативою ретельної пробопідготовки у разі є застосування предколонки, що захищає основну колонку від забруднення.
Іноді пробопідготовку доцільно взагалі проводити, а поставити в лінію перед основною колонкою ін-лайн фільтр і предколонку. Перевагами цієї схеми є простота та експресність аналізів при меншій витраті праці та реагентів.
10. Консервація хроматографічних колонок. Перед досить тривалим зберіганням хроматографічні колонки промиваються та заповнюються розчинником, цілком визначеним для кожного типу нерухомої фази.
Так, хроматографічні колонки для роботи в нормальнофазових системах зазвичай заповнюються висококиплячим вуглеводнем, наприклад, ізооктаном. Обернені фази промивають водою і заповнюють ацетонітрилом, або на невеликій швидкості подачі - ізопропанолом. Фази, призначені для роботи з водними буферами, заповнюються водою з невеликою добавкою натрію азиду (бактеріостатика).
Інструкції зі зберігання колонки можуть бути зазначені в її паспорті.
11. Зберігання водяних буферів. У разі проведення рутинних визначень досить зручно готувати відразу великий об'єм водного буфера для приготування рухомої фази. На жаль, водний буфер не може зберігатися більше кількох днів, якщо не додати до нього азид натрію, бактеріостатик. Дуже погано зберігаються рухливі фази з урахуванням фосфатного буфера.
Іноді великий обсяг водяного буфера готують для того, щоб "підвищити відтворюваність аналізу". Взагалі кажучи, за такого підходу продуктивність аналізу не підвищується, тоді як проблеми зі зберіганням буфера з'являються неминучі.
Взагалі ж, відповідь на запитання – чи готувати водний буфер на тиждень чи на один день? - Визначається виключно принципом зручності.
12. Регулярність проведення калібрування. Як правило, калібрування за стандартом проводять щодня, або щоразу при приготуванні нового елюенту.
Калібрування проводиться при досягненні стаціонарного стану хроматографічної системи; параметрами, що зчитуються, є час утримання піку стандарту, його площа (при спектрофотометричному детектуванні - на опорній довжині хвилі), спектральні відносини (при застосуванні скануючого або діодно-матричного спектрофотометричного детектора).
На початку роботи стандарт може бути проаналізований двічі – для підтвердження відтворюваності часу утримання.
1. Визначення компонентів препарату "БІЦИЛІН-3" методом ВЕРХ
Біцилін-3 є пеніциліном пролонгованої дії і є сумішшю натрієвої, новокаїнової та бензатинової солей бензилпеніциліну (БП). За діючою ВФС 42-3034-98 визначення БП в препараті проводять за допомогою ВЕРХ, новокаїн визначають спектрофотометрично, а бензатин (N,N1-дибензилетилендіамін) екстрагують ефіром водного розчину, насиченого хлоридом натрію. Після випарювання ефіру бензатин визначають титруванням хлорною кислотою.
У Європейській Фармакопеї вміст БП та бензатину у бензатиновій солі БП визначають за допомогою градієнтної ВЕРХ у суміші метанолу з розчином фосфату натрію при рН 3,5.
Мета роботи – розробка методу ВЕРХ в ізократичному режимі для визначення компонентів у біцилін-3.
експериментальна частина
Використовували біцилін-3 виробництва АКО "Синтез" (Курган). Дослідження проводили на хроматографі фірми "Waters" (США) з насосом моделі 510, УФ-детектором моделі 481 та інжектором моделі 7125 (Rheodyne) з дозуючою петлею місткістю 50 мкл. Для детектування використовували довжину хвилі 214 нм, коли добре детектуються всі аналізовані сполуки. Реєстрацію хроматограм та розрахунок площ піків та основних параметрів утримування проводили за допомогою персонального комп'ютера з аналого-цифровим перетворювачем та програмою "Мультихром".
Було вивчено оберненофазний варіант методу ВЕРХ на колонці "Luna C18 (2)" розміром 250 х 4,6 мм фірми "Phenomenex" (США), оскільки колонка зарекомендувала себе раніше як відносно дешева з покращеною симетрією виходу піків органічних амінів. З цією ж метою в якості рухомої фази використовували суміш ацетонітрилу з буферним розчином, що містить як один з компонетів триетиламін, що має pH 5,0.
Вихідний розчин для приготування рухомої фази - 2,5 М розчин фосфорної кислоти, який титрували триетиламін до рН 5,0. Буферний розчин для ВЕРХ отримували розведенням вихідного розчину водою в 10 разів.750 мл отриманого буферного розчину змішували з 250 мл ацетонітрилу. При цьому значення рН рухомої фази, що здається, підвищувалося до 5,7. Швидкість рухомої фази 1 мл/хв. Хроматографування проводили за кімнатної температури. Час аналізу 20 хв.
Оскільки компоненти, що входять до складу препарату, розрізняються за кислотно-основними властивостями - БП є кислотою, а новокаїн і бензатин - основами, при збільшенні рН їх часи утримування в інтервалі рН, де їх іонізація змінюється, зсуваються в різні боки. Тому шляхом зміни рН легко підібрати зручне утримання аналізованих компонентів. Однак збільшення рН призводить до помітного погіршення форми піку бензатину, а зменшення - до недостатнього дозволу новокаїну та продуктів гідролізу БП. Поділ компонентів біциліну-3 за зазначених вище умов представлено малюнку. Часи утримування новокаїну, бензатину та БП становили 4,2, 11,6 та 14,8 хв відповідно.
Істотним є вихід піку новокаїну між 2 піками, що є продуктами гідролізу БП. У зв'язку з цим для кращого поділу компонентів рекомендується додавати в рухому фазу невеликі кількості 2,5 М розчинів фосфорної кислоти або триетиламіну і контролювати поділ хроматографування суміші новокаїну та БП, розчин якого зберігався близько доби при кімнатній температурі.
Для кількісного визначення 20-25 мг біциліну-3 вносили в мірну колбу місткістю 100 мл і розчиняли у 20% водному розчині ацетонітрилу. Використання розчинення метанолу або його розчинів вело до часткового метилювання БП. Збільшення концентрації ацетонітрилу призводило до розширення піку новокаїну. Верхня межаконцентрації лікарської речовини обмежений її розчинністю. Калібрувальні графіки для БП та бензатину отримували з використанням натрієвої солі БП та діацетату бензатину після відповідного перерахунку. Калібрувальний графік для БП лінійний в ділянці 0,1-0,5 мг/мл, для бензатину і новокаїну - в ділянці 0,01-0,05 мг/мл. Результати визначення компонентів у 5 серіях препарату представлені в табл.1, де кожне значення є середнім з 5 визначень. Відносне середнє квадратичне відхилення становило 1,6% для новокаїну, 3,4% для бензатину та 1,4% для БП.
З табл.1 випливає, що результати кількісного визначення за допомогою ВЕРХ укладаються в допустимі межі, які регламентуються НД.
Для підтвердження правильності запропонованої методики були проаналізовані компоненти біциліну-3 у модельних сумішах, приготованих змішуванням натрієвої солі БП, бензатину діацетату та новокаїну. Результати наведено у табл.2. Результати перераховані на вихідні компоненти.
Кожне значення у графі "Знайдено" табл.2 – середній результат 3 визначень. Середня величина відносного відхилення склала 2,2 % для бензатину, 0,9 % для новокаїну та 0,8 % для БП, що корелює з відносними середніми стандартними відхиленнями, знайденими під час аналізу компонентів у реальних пробах. Для бензатину розкид результатів дещо вищий, ніж для інших компонентів, що пояснюється низькою висотою і неправильною формоюпіку та відповідно більшою помилкою інтегрування. Іншою причиною щодо великих помилокпри визначенні бензатину може з'явитися ефект пам'яті інжектора при аналізі речовин, що сильно адсорбуються. Однак і такий розкид, що трохи перевищує прийнятий для аналізів за допомогою методу ВЕРХ, цілком допустимий для визначення бензатину.
Висновки
1. Розроблено методику виявлення та кількісного визначення компонентів у препараті "Біцилін-3".
2. Методика перевірена на ряді серій препарату та підтверджена аналізом модельних сумішей відомого складу.
2. ВЕРХ в аналізі препаратів, що містять пропіфеназон
Пропіфеназон (4-ізопропіл-2,3-диметил-1-феніл-3-піразолін-5-он; ізопропілантипірин) відноситься до ненаркотичних аналгетиків піразолонового ряду і входить до складу комбінованих безрецептурних препаратів. В даний час в лікувальній практиці широко використовуються таблетки кафетин (склад: пропіфеназону-0,21 г, парацетамолу-0,25 г, кофеїну-0,05 г, кодеїну фосфату-0,01 г) та саридону (парацетамолу-0,25 г г, пропіфеназону-0,15 г, кофеїну-0,05 г). Відповідно до існуючої нормативної документації для підтвердження справжності таблеток кафетину використовується хроматографія в тонкому шарі сорбенту. Кількісне визначення запропоновано проводити в окремих навішуваннях препарату різними для кожного компонента методами: за допомогою спектрофотометрії, титриметрії, поєднання тонкошарової хроматографії та спектрофотометрії. У нормативній документації на саридон парацетамол, кофеїн та пропіфеназон визначають методом ВЕРХ на колонках довжиною 12,5 см з сорбентом Merck Lichrospher C18 та рухомою фазою складу: метанол-0,01 М фосфорна кислотау співвідношенні 30: 70.
Мета справжньої роботи - розробка методик виявлення та кількісного визначення компонентів таблеток кафетину та саридону за допомогою ВЕРХ.
У роботі використовували таблетки кафетину виробництва "Алкалоїд Скоп'є" (Республіка Македонія), саридону виробництва "Лабораторія Рош Ніколас С. А.", Гайярд (Франція) та субстанції компонентів, що входять до їх складу. Дослідження проводили на вітчизняному мікроколоночному рідинному хроматографі "Міліхром-4" з УФ-спектрофотометричним детектором, колонкою довжиною 8 см з обернено-фазовим сорбентом Сепарон-С18 як нерухома фаза. Полярний характер аналізованих сполук, їх хороша розчинність у воді та ацетонітрилі зумовили вибір водно-ацетонітрильних сумішей у різних співвідношеннях як рухомий фази. Випробували рухливі фази ацетонітрил - вода у співвідношеннях 9: 1; 7: 3; 6: 4; 8: 2 та ацетонітрил-вода-діетиламін (3: 2: 0,2). Уникали використання рухомих фаз з об'ємною часткою органічного розчинника більше 80%, щоб виключити нормально-фазові взаємодії, що ускладнюють подальше регулювання складу рухомої фази. Об'ємна частка розчинника менше 5% призводить до функціональної нестійкості рухомої фази та невідтворюваності часів утримування. Введення до складу рухомої фази діетиламіну як модифікатора дозволило домогтися поділу всіх 4 компонентів таблеток кафетин. Відомо, що на поверхні октадецилсилікагелю знаходиться значна кількість залишкових силанольних груп, здатних до іонообмінної взаємодії. Діетиламін виключає з хроматографічного процесу силанольні групи, покращує форму піків, скорочує час аналізу та регулює рН на поверхні силікагелю. Вимірювання проводили в таких умовах: масштаб реєстрації 2,0, час утримування 0,8 с, швидкість витрати елюентів 50 мкл/хв, обсяг проби, що вводиться 3 мкл. Детекцію піків здійснювали при 2 довжинах хвиль - 238 та 276 нм.
Ідентифікацію проводили за параметрами утримування, які визначали попередньо стандартних розчинах досліджуваних речовин.
Компоненти таблеток кафетину розділені при використанні рухомої фази ацетонітрилвода-діетиламін (3: 2,2: 0,2). Час утримання парацетамолу становив 3,08 хв, пропіфеназону - 5,73 хв, кофеїну - 4,0 хв, кодеїну - 4,67 хв.
Компоненти саридону можна розділити, використовуючи рухливу фазу ацетонітрил-вода (8: 2). Час утримання для парацетамолу – 3,9 хв, пропіфеназону – 5,11 хв, кофеїну – 4,44 хв.
Для кількісного визначення застосовували метод абсолютного калібрування. Пряма пропорційна залежність концентрації речовини від висоти піку спостерігалася парацетамолу в діапазоні 50-200 мкг/мл, для пропіфеназону - 25-128 мкг/мл, кофеїну - 20-50 мкг/мл, кодеїну - 59-234 мкг/мл/мл.
Метод ВЕРХ має певні обмеження в аналізі складних сумішей. При одночасному присутності в суміші речовин у макро- і мікрокількостях виникає перевантаження колонки, що впливає на якість поділу і форму піків, що виходять. У кафетині вміст кодеїну фосфату по відношенню до парацетамолу та пропіфеназону в 21-25 разів менший, тому рекомендується рідинна екстракція для відокремлення кодеїну від інших компонентів таблеток. Попередньо ми встановили, що парацетамол, пропіфеназон і кофеїн вилучаються при одноразовій екстракції етилацетатом з водних розчинів при рН 2,0 у кількості відповідно 87,43, 87,29 та 87,84%, а кодеїн повністю залишається у водному розчині та для його вилучення та концентрування необхідно використовувати хлороформ при рН 9,0-10,0.
Методика кількісного визначення парацетамолу, пропіфеназону і кофеїну в таблетках саридону і кафетину. і ретельно перемішують.
Вміст колби доводять до мітки ацетонітрилом, перемішують та фільтрують. Розчин вводять у колонку хроматографа обсягом 3,0 мкл. Вміст парацетамолу, пропіфеназону та кофеїну визначають методом абсолютного калібрування. Результати визначення наведено в табл.1 і 2, з яких видно, що отримані дані укладаються в допустимі межі змісту нормативної документації (НД).
Методика кількісного визначення кодеїну фосфату у таблетках кафетину.Близько 0,2 г розтертих таблеток (точна навішування) розчиняють у 20 мл води, добре перемішують до отримання однорідного розчину, фільтрують через фільтр для дрібних і дрібних опадів, фільтр промивають 10 мл очищеної води. Розчин підкислюють 10% розчином сірчаної кислоти до 2,0 рН. Тричі екстрагують етилацетатом порціями по 10 мл. Екстракти відкидають. До водного розчину додають 25% розчин аміаку до pH 9,0-10,0. Тричі екстрагують хлороформом порціями по 10 мл. Об'єднані хлороформні витяжки поміщають у порцелянові чашки і випаровують при кімнатній температурі. Сухі залишки розчиняють в ацетонітрилі, переносять у мірну колбу місткістю 25 мл і доводять до мітки тим же розчинником. Результати визначення наведено у табл.3.
Для оцінки точності запропонованих методик та перевірки відтворюваності результатів були приготовлені та досліджені модельні суміші. Дані з прикладу таблеток саридона наведено в табл.4. Як видно з табл.4, відносна похибка визначення не перевищує парацетамолу ±1,19%, пропіфеназону ±1,16%, кофеїну ±1,63%.
Методика кількісного визначення компонентів таблеток саридону у модельних сумішах.Відважують точні навішування парацетамолу (близько 0,08 г), пропіфеназону (близько 0,05 г) і кофеїну (близько 0,016 г), переносять у мірну колбу місткістю 50 мл, розчиняють у невеликому обсязі ацетонітрилу і доводять до мітки. Відбирають аліквоту 2,5 мл і переносять у мірну колбу місткістю 25 мл, об'єм до мітки доводять тим самим розчинником, перемішують і фільтрують. Розчин вводять у колонку хроматографа обсягом 3 мкл.
Висновки
1. Розроблено методику виявлення компонентів таблеток кафетину та саридону за допомогою ВЕРХ.
Час утримання для парацетамолу становив 3,08 хв, для пропіфеназону – 5,73 хв, кофеїну – 4 хв та кодеїну – 4,67 хв.
2. Запропоновано метод ВЕРХ для кількісного визначення компонентів таблеток кафетину та саридону.
Відносна помилка визначення склала для парацетамолу ±1,19-1,21%, пропіфеназону ±1,16-1,71%, кофеїну ±1,22-1,63% та для кодеїну ±2,95%.
3. Стандартизація препарату "Аданол"
Фармацевтичною фірмою "Полісан" розроблено низку комплексних лікарських препаратів метаболічної дії, що стимулюють обмінні процеси головного мозку, у тому числі "Цитофлавін" (ін'єкції, таблетки) та "Аданол". "Аданол" володіє вираженими антигіпоксичними та протиішемічними властивостями і є перспективним лікарським засобомдля лікування хворих із наслідками інсульту. Він є таблетованою лікарською формою, покритою кишково-розчинною оболонкою.
До його складу входять янтарна кислота (ЯК), пірацетам (Пц), рибоксин (Рб), нікотинамід (НА), піридоксину гідрохлорид (ПГ), рибофлавін мононуклеотид (РФ).
Мета роботи - розробка методу якісного та кількісного визначення ЯК у складних багатокомпонентних сумішах на прикладі препарату "Аданол".
У роботі використовували рідинний хроматограф високого тиску фірми "Shimadzu" (Японія) з УФ-детектором та колонкою Hypersil BDS C18 фірми "Supelco Inc." зерненням 5 мкм, довжиною 250 мм із внутрішнім діаметром 4,6 мм. Рухлива фаза – водно-органічна фаза на основі фосфатного буфера (рН 2,6-7,0). Довжина хвилі детектування 206 нм. Режим аналізу ізократичний, швидкість елюювання 500 мкл/хв; об'єм проб 20 мкл. УФ-спектри знято на спектрофотометрі UV mini-1240 фірми "Shimadzu".
Для кількісного визначення більшості субстанцій, що входять до складу препарату, запропоновано спектрофотометричні методи аналізу. Однак порівняння спектральних характеристик компонентів препарату показало, що поглинання області ЯК, ПГ, НА, Рб і Пц в УФ-зоні перекривають один одного (рис.1).
У зв'язку з цим вміст їх у суміші не можна визначати методом прямої спектрофотометрії і в такому разі доцільно використовувати метод ВЕРХ. Тільки РФ має специфічну область поглинання більше 350 нм (лmax = 373, Е1% 1см = 202 і лmax = 445 нм, Е1% 1см = 243), тому для нього запропонований якісний та кількісний аналіз спектрофотометричним методом.
На основі отриманих даних обрано оптимальну робочу довжину хвилі для аналізу 5 субстанцій, що становить лопт=206 нм (див. рис.1). Це значення є максимумом УФ-спектру ЯК, яка має найменше питоме поглинання (лmax=206 нм Е1% 1см= 5,8) в порівнянні з іншими компонентами суміші (див. таблицю).
Оскільки всі речовини, що входять до препарату, іоногенні, для їх аналізу доцільно застосовувати обернено-фазну хроматографію з використанням неполярної нерухомої та полярної рухомої фаз. При обернено-фазній хроматографії іоногенних сполук значення водневого показника – один із факторів, який суттєво впливає на ефективність поділу індивідуальних речовин. Працюючи з сучасними обращенно-фазными сорбентами у складі рухомий фази зазвичай використовують буферні розчини рН від 2,0 до 8,0. Так як обране оптимальне значення робочої довжини хвилі дорівнює 206 нм, то краще застосовувати фосфатний буфер, тому що він не має положення в УФ-діапазоні довжин хвиль більше 200 нм.
Для вивчення поведінки ЯК при різних значенняхрН були зняті її спектри у фосфатних буферних розчинах рН 7,0 та 2,6 (рис.2). При рН 2,6 спостерігається гіпохромний ефект молекулярної форми ЯК - поглинання знижується в 3 рази порівняно із спектром при рН 7,0 (при цьому значенні рН дисоціація ЯК повністю пригнічена). З огляду на це оптимальним значенням рН рухомої фази є 7,0. Далі було вивчено вплив складу та рН рухомої фази на ефективність поділу компонентів препарату. При рН 2,6 не відбулося повного поділу суміші на індивідуальні піки - Пц, На та ПГ не діляться і виходять першими одним піком, за ними слідують ЯК та Рб у вигляді індивідуальних піків. При рН 5,5 також був повного поділу компонентів. При рН 7,0 відбувся повний поділ компонентів суміші. Усі речовини виходили як окремих піків у наступній послідовності: ЯК, Пц, ПГ, НА і Рб. Однак процес поділу тривалий – 45-50 хв.
Для забезпечення більшої елююючої сили рухомої фази та прискорення процесу поділу необхідно ввести до її складу менш полярний органічний розчинник. З розчинників, найбільш часто вживаних як елююючих агентів у ВЕРХ, за межею прозорості в УФ-світлі при вибраній робочій довжині хвилі (лопт = 206 нм) ми могли застосувати ацетонітрил і метанол, у яких межі прозорості рівні 195 і 205 н.
При введенні до складу рухомої фази 2% метанолу час процесу скоротився, проте пік НА мав високу асиметрію і пік Рб накладався на хвіст піку НА. Після зниження концентрації метанолу до 1% піки Рб та НА не перекривалися, проте асиметрія піку НА збільшилася. З метою її зниження рухому фазу, що містить 1% метанолу, вводили ацетонітрил.
В результаті експериментів була підібрана рухома фаза - водно-органічна фаза, що складається з фосфатного буфера рН 7,0, що містить 1% метанолу та 0,5% ацетонітрилу, яка забезпечила ефективний поділ усіх 5 компонентів (рис.3). Загальний час хроматографування в цій системі становив 35 хв, а часи утримування компонентів приблизно (в хв): у ЯК – 5,3, Пц – 15, ПГ – 19,3, НА – 26, Рб – 31.
Кількісне визначення проведено методом зовнішнього стандарту з використанням стандартних розчинів зразків індивідуальних компонентів.
Метрологічні характеристики запропонованої методики кількісного визначення вивчені на модельних сумішах у 5 повторностях та представлені в таблиці.
Як випливає з таблиці, за допомогою розробленої методики препарату "Аданол" можна визначати всі 5 компонентів з відносною помилкою не більше 3% з довірчою ймовірністю 95%.
Крім піків основних компонентів препарату, на хроматограмі, отриманій у вищеописаних умовах, ідентифіковані піки гіпоксантину та нікотинової кислоти, присутніх у вихідних субстанціях, а також утворюються в процесі гідролізу з Рб та НА відповідно. Таким чином, розроблена методика дозволяє якісно та кількісно визначити ці сторонні домішки у препараті.
Висновки
1. Визначено оптимальні умови кількісного аналізу бурштинової кислоти із застосуванням методу ВЕРХ у багатокомпонентній суміші.
2. Розроблено методику якісного та кількісного аналізу компонентів препарату "Аданол", включаючи домішки, з відносною помилкою визначення не більше 3%.
Список використаної літератури
1. М.А. Казьмін, А.В. Михалєв, А.П. Арзамасцев "Визначення компонентів препарату "БІЦИЛІН-3" методом ВЕРХ"// Фармація - №5 - 2002 - с.5-6.
2. Т.Х. Вергійчик, Н.С. Онегова "ВЕРХ в аналізі препаратів, що містять пропіфеназон" // Фармація - №6 - 2002 - с.13-16.
3. А.Ю. Петров, С.А. Дмитриченко, О.Л. Коваленко, Л.Є. Алексєєва "Стандартизація препарату "Аданол"// Фармація - №5 - 2002 - с.11-13.
Додаткова
1. Барам Г.І., Федорова Г.А. // Застосування хроматографії у харчовій, мікробіологічній та медичній промисловості: Мат. Всі з. Конф. – Геленджик, 1990 р. – С.43-44.
2. Кричковська Л.В., Чорненька Л.А. // Застосування хроматографії у харчовій, мікробіологічній та медичній промисловості: Мат. Всі з. Конф. - Геленджик, 8-12 жовтня 1990, М., 1990. - С.49.
3. Хроматографія: Практичний додаток методу: У 2-х частинах. Ч.2 – М.: Світ, 1986. – 422 с.